На правах рукописи

МИХАЙЛОВА Екатерина Михайловна

БАКТЕРИИ РОДА GEOBACILLUS ИЗ ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫХ

ЗАВОДНЯЕМЫХ НЕФТЯНЫХ ПЛАСТОВ И ГЕНЫ БИОДЕГРАДАЦИИ

н-АЛКАНОВ (alkB)

Специальность 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИМНИ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Назина Тамара Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Бонч-Осмоловская зав. лабораторией гипертермофильных Елизавета Александровна микробных сообществ ИНМИ РАН доктор биологических наук, в.н.с. Семенов Александр Михайлович кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, Факультет биотехнологии и промышленной экологии.

Защита диссертации состоится “28“ мая 2012 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им.

С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат диссертации разослан “ ”апреля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микроорганизмы нефтяных пластов служат объектом исследования с 1926 года. С использованием микробиологических, радиоизотопных и молекулярно-биологических методов в пластовых водах выявлены анаэробные бродильные, сульфат-, серо-, тиосульфат- и железоредуцирующие прокариоты, ацетогены и метаногены (Назина, Беляев, 2004; Magot et al., 2000; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Аэробные бактерии обнаружены в заводняемых нефтяных пластах, куда они, вероятно, проникают с буровым раствором и нагнетаемой водой при разработке месторождения (Розанова, Кузнецов, 1974). Растворенный кислород поступает в пласт с нагнетаемой водой и способствует росту аэробных микроорганизмов (Кузнецова, Ли, 1964; Иванов и соавт., 1982; Розанова, Назина, 1982). Показано, что в заводняемом нефтяном пласте обитает аэробно-анаэробное микробное сообщество.

Особый интерес представляют аэробные углеводородокисляющие бактерии, которые являются первым звеном трофической цепи, основанной на биодеградации нефти. Из нефтяных пластов выделен ряд мезофильных углеводородокисляющих бактерий. Термофильным аэробным бактериям посвящено немного работ.

Выделенные из нефтяных пластов термофильные бактерии относятся к родам Bacillus, Geobacillus, Thermoactinomyces, Thermus и Petrobacter (Nazina et al., 2001, 2005; Hao et al., 2004; Salinas et al., 2004).

Изучение углеводородокисляющих бактерий актуально для решения фундаментальных и прикладных задач. При окислении углеводородов бактерии образуют поверхностно-активные вещества (ПАВ), способствующие проникновению углеводородов в клетку. ПАВ существенно изменяют реологические свойства нефти, что обусловливает использование этих бактерий в технологиях повышения нефтеотдачи (Беляев и соавт., 2004; Youssef et al., 2009). По геохимическим данным, температура залежей деградированной нефти не превышает 80°C (Head et al., 2004). Однако аэробные и анаэробные микроорганизмы, осуществляющие окисление нефти при столь высокой температуре, пока не выделены.

Кроме того, не исследованы генетические аспекты биодеградации углеводородов термофильными прокариотами. У мезофильных аэробных бактерий хорошо изучены гены alkB, кодирующие фермент алкан-монооксигеназу, который вводит атом кислорода в концевой атом н-алкана. Сведений о генах биодеградации углеводородов термофильных микроорганизмов практически нет. К началу настоящей работы в Генбанке было лишь два фрагмента последовательностей alkB генов термофильных бактерий рода Geobacillus.

Геобациллы неоднократно выделяли из нефтяных пластов, но молекулярными методами геобациллы выявляли лишь однажды (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003).

Методы анализа генов 16S рРНК, выявленных во фракции ДНК микроорганизмов пластовой воды, направлены на выявление последовательностей всех присутствующих прокариот, но не позволяют оценить степень их активности в пласте. Подобные исследования микробных сообществ выполнены на высокотемпературных нефтяных пластах США (Orphan et al., 2000; Gieg et al., 2010), Западной Сибири (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003), Китая (Назина и соавт., 2006;

Shestakova et al., 2011; Li et al., 2006 и др.). Известно, что в растущей клетке существенно возрастает количество рибосом, поэтому анализ фракции рРНК, выделенной из исследуемой пробы, позволяет выявить метаболически активные компоненты сообщества (Poulsen et al., 1993). Данный подход не применялся для изучения микроорганизмов нефтяных пластов, что свидетельствует об актуальности этих исследований.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение разнообразия микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов (на примере нефтяного месторождения Даган) и выявление метаболически активных прокариот, выделение аэробных термофильных углеводородокисляющих бактерий и поиск генов ферментативной системы окисления н-алканов у представителей рода Geobacillus и в подземном микробном сообществе.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи.

1. Определить численность и распространение микроорганизмов основных метаболических групп в пластовых водах месторождения Даган.

2. Выделить доминирующие термофильные углеводородокисляющие бактерии, определить их таксономическое положение и метаболические свойства, способствующие распространению и деятельности в нефтяных пластах. Исследовать рост выделенных штаммов на углеводородах нефти и индивидуальных н-алканах.

3. Осуществить поиск генов ферментативной системы биодеградации налканов у бактерий рода Geobacillus.

4. Определить филогенетическое разнообразие прокариот и выявить метаболически активные группы путем создания библиотек клонов генов 16S рРНК и alkB и 16S крДНК (комплементарной 16S рРНК) на основе тотальных ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины в период биотехнологического воздействия.

Научная новизна работы. Впервые для анализа микробного сообщества нефтяного пласта применен комплексный подход, сочетающий микробиологические и радиоизотопные методы с молекулярно-экологическим методом, основанным на анализе генов 16S рРНК и alkB в библиотеках клонов, созданных на основе ДНК и РНК, выделенных из пластовой воды. Показано, что аэробные спорообразующие бактерии рода Geobacillus доминируют в посевах наибольших разведений пластовой воды на среды с н-алканами и сырой нефтью, что подтверждается выделением чистых культур (G. subterraneus, G. stearothermophilus) и доминированием генов 16S рРНК геобацилл в ДНК-библиотеке клонов микробного сообщества пластовой воды.

Выделенные и коллекционные штаммы геобацилл окисляют н-алканы нефти с длиной цепи C12–C29-31 при температуре инкубации от 45 до 70–75°C. При исследовании 11 штаммов, принадлежащих к разным видам рода Geobacillus, впервые обнаружено 8 различных гомологов гена alkB (alkB-geo1 – alkB-geo8), кодирующего фермент алкан-монооксигеназу. В геноме каждого штамма геобацилл присутствовало от 3-х до 6-и гомологов гена alkB, из которых только alkB-geo1 и alkB-geo4 были универсальны для всех штаммов. Последовательности alkB-geo1 – alkB-geo6 гомологов геобацилл имеют 87.7-99.2% сходства с генами alkB бактерий рода Rhodococcus, что не позволяет использовать эти гены для детекции геобацилл в природном местообитании. Впервые выявлено доминирование последовательностей геобацилл в библиотеках клонов генов 16S рРНК и alkB, созданных на основе ДНК из пластовой воды призабойной зоны нагнетательной скважины высокотемпературного нефтяного пласта. Биодеградация нефти в пласте сопровождается увеличением содержания растворенных минеральных карбонатов, обогащенных изотопом 12С, и летучих кислот в пластовой воде. Выявлены последовательности 16S рРНК мезофильных и термофильных аэробных органотрофных и бродильных бактерий, а также микроорганизмов цикла серы, что свидетельствует о метаболической активности этих микроорганизмов в нефтяном пласте.

Научно-практическая значимость работы. Выделенные бактерии рода Geobacillus могут использоваться в биотехнологиях очистки от нефти при высокой температуре, а также в биотехнологиях повышения нефтеизвлечения для интродукции в высокотемпературные нефтяные пласты. Метод анализа ДНК- и РНК-библиотек клонов генов 16S рРНК и 16S крДНК микроорганизмов пластовой воды, позволяющий полнее охарактеризовать микробное сообщество и выявить метаболически активные микроорганизмы, может быть рекомендован для выбора участков пласта, пригодных для применения биотехнологии повышения нефтеизвлечения, основанной на активации пластовой микрофлоры. Результаты изучения генов биодеградации н-алканов у термофильных прокариот и экологии микроорганизмов нефтяных пластов могут быть использованы при чтении лекций по микробиологии в высших учебных заведениях.

Исследования выполняли в 2002-2012 годах при поддержке РФФИ (гранты №№ 02-04-39002, 05-04-39029 и 06-04-49128), Китайской национальной нефтяной компании (контракт DFT04-122-IM-18-20RU), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF RBO-1364-MO и RBO-1364-MO-02) и Миннауки РФ (Ведущая научная школа академика РАН М.В. Иванова, 2006-РИ-112.0/001/ и НШ-1189.2012.4).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-м Московском Международном конгрессе “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2005), II и III Международной молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии” (Москва, 2006, 2007) и симпозиумах (International Symposium for Subsurface Microbiology) (Джексон-Холл, США, 2005; Шизуока, Япония, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей и 5 тезисов.

Место проведения работы. Работа проводилась в ИНМИ РАН (лаборатория нефтяной микробиологии) под руководством д.б.н. Т.Н. Назиной и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ЦКП “Геном”) под руководством к.б.н. А.Б.

Полтарауса. В отдельных этапах работы принимали участие Н.М. Шестакова, В.С.

Ивойлов и Д.Ш. Соколова. Геносистематические работы проводили совместно с д.б.н. Т.П. Туровой, ДНК-ДНК гибридизацию – с к.б.н. А.М. Лысенко, жирные кислоты клеточной стенки анализировали под руководством д.б.н. Г.А. Осипова.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н.

Т.Н. Назиной, профессору, д.б.н. С.С. Беляеву, к.б.н. А.Б. Полтараусу и д.б.н. Т.П.

Туровой за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов. Автор благодарит всех коллег, друзей и свою семью за полезные советы и поддержку.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают 17 рисунков и 19 таблиц.

Диссертация состоит их разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Экспериментальная часть”, включающая “Объекты и методы исследования”, “Результаты”, “Обсуждение результатов”, “Выводы” и “Список литературы”, который содержит 54 отечественных и 215 зарубежное наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика нефтяного месторождения Даган. В работе исследовали микроорганизмы пластовой воды залежи Кондиан месторождения Даган, расположенного в провинции Хебей (КНР). Температура исследованных песчаных нефтеносных горизонтов составляла 59°C, глубина – 1206–1435 м. Нефть месторождения с плотностью 0.900 г/см3 содержала 53% насыщенных углеводородов, 20% ароматических соединений и 27% асфальтенов + смолы.

Пластовые воды гидрокарбонатно-натриевого типа имели низкую минерализацию, рН 7.1–7.6.

Отбор проб. Пробы пластовой воды и нефти из добывающих скважин и воду из остановленной нагнетательной скважины, переведенной в режим обратного излива, отбирали в стерильные герметично закрывающиеся бутыли. Посев пластовой воды для определения численности микроорганизмов, проводили в течение 4–6 часов после отбора. Пластовую воду (1 л), предназначенную для выделения нуклеиновых кислот, фиксировали спиртом (1:1) непосредственно в момент отбора, затем в лаборатории отделяли от нефти путем экстракции гексаном и декантации при комнатной температуре. Фиксированную воду хранили при 4°C до проведения молекулярно-биологических исследований.

Микроорганизмы, использованные в работе, включали выделенные соискателем культуры и штаммы из коллекции лаборатории: G. stearothermophilus DSM 22T, G. thermoleovorans DSM 5366T, G. subterraneus 34T, Sam и B1023-2, G.

jurassicus DS1T и DS2, G. thermocatenulatus VKM B-1259T, G. uzenensis UT и Х, G.

gargensis GaT, G. toebii vw3-1n и B1024, G. thermoglucosidans 3Feng. Видовые названия геобацилл соответствуют списку валидно описанных видов Euzeby (2008) [http://www.bacterio.cict.fr/g/geobacillus.html], без учета ревизии этого рода, выполненной в конце 2011 г. (Coorevits et al., 2011).

Состав питательных сред, условия культивирования и учёта микроорганизмов. Численность микроорганизмов определяли путем посева пластовой воды в жидкие среды методом десятикратных разведений в двух повторностях. Для учета аэробных органотрофов использовали среду, содержащую (г/л): бакто-триптон (Difco) – 5.0, дрожжевой экстракт (Difco) – 2.5, глюкозу – 1.0, pH 7.0–7.2.

Анаэробную технику Хангейта (Hungate, 1969) использовали для приготовления сред для анаэробных бактерий. Численность бактерий с бродильным типом метаболизма оценивали в среде с бакто-пептоном (4 г/л) и глюкозой (10 г/л) по образованию H2 в конечных разведениях и микроскопированием (Postgate, 1984).

Сульфатредуцирующие бактерии анализировали по образованию H2S в среде Постгейта (Postgate, 1984) с лактатом натрия (4 г/л). Метаногенов учитывали, оценивая образование CH4 в конечных разведениях в среде с ацетатом (2.2 г/л) или H2+CO2 (Zeikus et al., 1975). Посевы инкубировали при 30 и 60°C в течение 7–14 сут, отсутствие роста регистрировали после 30 сут инкубации.

Рост аэробных термофильных бактерий на различных субстратах, н-алканах и нефти исследовали в модифицированной среде (Adkins et al., 1992) состава (г/л):

K2HPO4 – 1.5; KH2PO4 – 0.75; NH4Cl – 1; MgSO4 – 0.2; CaCl2 – 0.02; KCl – 0.1; NaCl – 5, pH 6.8–7.2. Посевы инкубировали в течение 3 сут при температуре 60°C. Посевы с нефтью инкубировали при различных режимах аэрации при температуре 60, 65, 70 и 75°C в течение 10 сут. Прирост биомассы определяли по изменению оптической плотности культуральной среды и численности бактерий, определяемой микроскопированием.

Аналитические методы. Содержание белка в микробной биомассе определяли колориметрическим методом Лоури (Lowry et al., 1951). Метан, водород и летучие кислоты определяли, используя газовый хроматограф.

Для анализа использования алифатической фракции нефти деградированную и контрольную нефть экстрагировали хлороформом (Walker et al., 1975). Пробу нефти наносили на колонку с силикагелем для получения очищенной алифатической фракции. Содержание прямоцепочечных и разветвленных н-алканов определяли методом газожидкостной хроматографии.

Скорости сульфатредукции и метаногенеза в пластовых водах определяли радиоизотопными методами, используя меченые Na235S04, 14CH3-COONa и NaH14CO (Беляев, Иванов, 1975; Лауринавичус, Беляев, 1978; Романенко, Кузнецов, 1974).

Состав стабильных изотопов углерода нефти и растворенных карбонатов определяли методом стандарт-пробы на масс-спектрометре МИ-1201В, используя в качестве рабочего газа СО2 (Иванов и соавт., 1982). Степень фракционирования стабильных изотопов углерода выражали величиной 13С (0/00) относительно международного стандарта PDB (Craig, 1953).

Молекулярно-биологические методы. Содержание Г+Ц в ДНК-препаратах определяли с помощью кривых плавления, используя ДНК Escherichia coli K-12 в качестве стандарта (Методы исследования нуклеиновых кислот, 1970). ДНК-ДНК гибридизацию проводили по методу Де Лея (De Ley et al., 1970). ДНК выделяли с использованием наборов “DiatomtmDNAprep” (Биоком, Москва), QIAGEN (США) и “Wizard MiniPrep” (Promega, США). Тотальную РНК выделяли с использованием тризола (“TRIzol Reagent”, Invitrogen) согласно протоколу. Синтез первой цепи кДНК (комплементарной ДНК) проводили с использованием набора для обратной транскрипции “Силекс” (Москва). Полученную кДНК сразу же использовали в качестве матрицы для ПЦР.

Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием универсальных архейных (A109f, A1041r) (Grokopf et al., 1998; Колганова и соавт, 2002) и бактериальных (8-27f, 519r, pHr, Pla46f) праймеров (Edwards et al., 1989; Weisburg et al. 1991; Schmid et al., 2000). Амплификацию генов alkB проводили с помощью предложенных нами праймеров Alk-BFB, Alk-BRB. Выделение и очистку ПЦРпродуктов проводили с помощью набора для экстракции ДНК из геля (V-gene DNA Gel Extraction Kit; China).

Очищенные фрагменты клонировали с помощью векторных систем pGEM-T (Promega) и pTZ57RT (Fermentas, США). Секвенирование проводили с использованием праймеров 8-27f, 519r, pHr, М13D и M13R на секвенаторе DNA Analyzer с использованием набора “BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits” (Applied Biosystems, США).

Последовательности анализировали с использованием программы BLAST сервера NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Нуклеотидные последовательности и полученные с помощью компьютерной трансляции аминокислотные последовательности alkB генов выравнивали с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья конструировали по методу ближайших соседей (neighbor-joining). Полученные в ходе работы последовательности помещены в Генбанк под номерами: AY682096, AY682097, EF534128–EF534180.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Распространение микроорганизмов в пластовой воде нефтяного Нефтяное месторождение Даган эксплуатируется с применением заводнения более 30 лет. В период 2001–2006 гг. на двух участках применялась биотехнология, направленная на повышение нефтеотдачи. Она заключалась в нагнетании водновоздушной смеси или раствора перекиси водорода с солями азота и фосфора.

Поступление растворенного кислорода с нагнетаемой водой стимулировало рост аэробных бактерий, осуществляющих биодеградацию нефти, и как следствие, рост анаэробных микроорганизмов, потребляющих продукты окисления нефти (табл. 1).

Нагнетание в пласт охлажденной воды приводит к снижению температуры в призабойной зоне нагнетательных скважин с 60 до 40-50°С, что способствует распространению как термофильных, так и мезофильных микроорганизмов (рис. 1).

Численность мезофильных и термофильных микроорганизмов исследованных физиологических групп в воде из призабойной зоны нагнетательной скважины была существенно больше, чем в воде из добывающих скважин (рис. 1).

Несмотря на обнаружение жизнеспособных мезофильных прокариот в пробах воды из добывающих скважин, скорости мезофильных процессов сульфатредукции и метаногенеза были низки или не регистрировались в этих пробах, тогда как в призабойной зоне нагнетательной скважины были выявлены термофильные и мезофильные процессы метаногенеза из ацетата и сульфатредукции (рис. 2а, б).

На исследованном участке Северного блока залежи Кондиан пластовые воды гидрокарбонатно-натриевого типа были низко минерализованными (4.8–6.6 г/л), слабощелочными (рН от 7.1 до 7.6). Сульфаты отсутствовали в нагнетаемой воде и в исходной пластовой воде и появлялись в результате технологического воздействия, достигая концентрации 175 мг/л (табл. 1). Сероводород (менее 2 мг/л) был выявлен в воде из призабойной зоны нагнетательной скважины 1098 (проба 8 м3), а в жидкости из добывающих скважин он отсутствовал.

Нагнетание окислителей в пласт приводило к биодеградации нефти в призабойной зоне нагнетательных скважин. Продукты окисления нефти с нагнетаемой водой поступали в зону добывающих скважин, что подтверждается увеличением содержания ацетата (от 0–5 до 52.4 мг/л) и минеральных карбонатов (от 402–470 до 721–1243 мг/л) в пластовой воде и снижением величины 13C суммы минеральных карбонатов (13С/СО2+НСО3-+ СО32-) пластовой воды с 6.4‰ до 5.6…12.9‰.

В 2006 г. в воде исследованных добывающих скважин Северного блока скорости анаэробных процессов были подавлены, вероятно, вследствие поступления H2O2 в пласт. Скорость сульфатредукции не превышала 4.62 мкг S2- л-1 сут-1, суммарная скорость метаногенеза не превышала 3.97 мкг CH4 л-1 сут-1 (табл. 1). Эти величины сравнимы со скоростями процессов в нефтяных пластах Западной Сибири, Китая и Аляски (Назина, Беляев, 2004; Gieg et al., 2010). В пластовой воде блока № 1 этой же залежи (скв. 1065-1) скорость образования метана была сравнима с таковой в водах Северного блока, тогда как скорость сульфатредукции была выше, достигая 22.4–67.04 мкг S2- л-1 сут-1 (данные не представлены).

Таблица 1. Физико-химическая характеристика пластовой воды, численность термофильных микроорганизмов (кл/мл) и скорости анаэробных процессов в воде залежи Кондиан нефтяного месторождения Даган Нагнета-