На правах рукописи

Костычев Андрей Александрович

Биоабсорбция тяжелых металлов и мышьяка агарикоидными и

гастероидными базидиомицетами

Специальность 03.00.24. – «Микология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2009 Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии и экологии ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА» и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ «ГосНИИЭНП», г.

Пенза

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Иванов Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Гарибова Лидия Васильевна доктор биологических наук, профессор Кураков Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН), г. Саратов

Защита состоится «_» 2009 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46. при Московском государственном университете им.

М.В. Ломоносова по адресу:

119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1, тел./факс: (495) 939-39-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» _ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейших экологических проблем современности является проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами. Среди живых организмов, населяющих природные экосистемы суши, способностью к активной биоабсорбции тяжелых металлов обладают базидиальные макромицеты. Однако биологический смысл и природная целесообразность такого явления, как и вопросы о метаболических функциях многих химических элементов в грибах пока до конца не выяснены. Существует прикладной аспект данной проблемы: нормативы содержания тяжелых металлов и других токсичных элементов в плодовых телах съедобных грибов требуют доработки. Остается открытым вопрос об усвояемости химических элементов организмом человека. В связи с этим, проблема оценки качества дикорастущей грибной продукции в настоящее время представляется заслуживающей внимания. Одной из причин этого является ограниченность сведений о видовой специфичности в накоплении тяжелых металлов и других токсичных элементов плодовыми телами съедобных грибов. Проблема биоабсорбции грибами химических элементов активно рассматривается и обсуждается специалистами, однако по сей день это направление остается одним из самых дискуссионных.

Цель и задачи исследований. Целью работы было изучение характера биоабсорбции тяжелых металлов и мышьяка плодовыми телами базидиальных макромицетов, а также влияния названных элементов на рассматриваемую группу грибов в чистой культуре.

В ходе выполнения исследований были поставлены следующие задачи:

1) на основании полевых исследований изучить абсорбционную способность различных видов базидиальных макромицетов в отношении железа, кобальта, марганца, никеля, свинца, цинка и мышьяка в условиях экосистем с различным уровнем техногенного загрязнения;

2) выявить виды, обладающие ярко выраженной избирательной способностью к биоабсорбции отдельных элементов;

3) изучить возможность синергизма и антагонизма в накоплении тяжелых металлов и мышьяка базидиомами макромицетов;

4) изучить особенности биоабсорбции изученных элементов представителями различных эколого-трофических и таксономических групп;

5) оценить возможность использования некоторых видов базидиальных макромицетов в качестве биоиндикаторов состояния окружающей среды;

6) изучить влияние тяжелых металлов и мышьяка на рост, развитие и интенсивность окислительного стресса базидиальных макромицетов – представителей различных эколого-трофических групп в условиях чистой культуры;

7) оценить вероятный риск поступления тяжелых металлов и мышьяка с плодовыми телами съедобных базидиомицетов в организм человека.

Научная новизна.

1) впервые в условиях целого ряда экосистем с различным уровнем и генезисом техногенного загрязнения изучен характер биоабсорбции некоторых тяжелых металлов и мышьяка базидиомами макромицетов;

2) впервые в условиях лесостепи выявлены виды дикорастущих грибов, характеризующиеся повышенной абсорбционной способностью по отношению к изученным элементам;

3) впервые с учетом специфики загрязнения территории предложены виды макромицетов, характерные для зоны исследования, в качестве потенциальных биоиндикаторов загрязнения окружающей среды отдельными химическими элементами;

4) впервые применен комплексный подход при изучении спектра факторов, способных модифицировать процесс биоабсорбции;

5) впервые изучено влияние свинца, хрома и мышьяка на рост, развитие мицелия в комплексе с оценкой интенсивности окислительного стресса у представителей различных эколого-трофических групп в условиях чистой культуры;

6) впервые, исходя из существующих международных нормативов, рассчитан и оценен вероятный риск поступления тяжелых металлов и мышьяка с плодовыми телами съедобных грибов в организм человека применительно к региону исследований.

Положения, выносимые на защиту.

1) элементный состав базидиом грибов определяется биологическими особенностями представителей отдельных видов, зависит от возраста базидиом и сроков их появления, при этом степень накопления элементов отличается у представителей различных эколого-трофических групп;

2) в условиях экосистем, испытывающих техногенное загрязнение, плодовые тела макромицетов накапливают существенное количество тяжелых металлов и мышьяка. В связи с этим некоторые виды могут быть рекомендованы в качестве биоиндикаторов состояния окружающей среды в отношении названных элементов;

3) способность ингибировать рост и развитие базидиальных макромицетов в чистой культуре у разных токсичных элементов неоднозначна, как и чувствительность к ним культур разных видов;

4) при изучении воздействия токсичных элементов на развитие базидиальных макромицетов в чистой культуре наиболее информативным является комплексный подход, при котором помимо традиционных культуральноморфологических признаков определяется интенсивность образования продуктов окислительной деструкции липидов.

Практическая значимость. Выявлены виды грибов, характеризующиеся повышенной абсорбционной способностью по отношению к изученным элементам. Предложены виды биоиндикаторов загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами и мышьяком. Оценен вероятный риск поступления тяжелых металлов и мышьяка в организм человека с плодовыми телами съедобных базидиомицетов. Результаты исследований используются при проведении экологического контроля и мониторинга Объекта ХУХО в п. Леонидовка Пензенской области.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Мониторинг природных экосистем в зонах защитных мероприятий объектов по уничтожению химического оружия» (Пенза, 2007); Всероссийской научно-технической конференции «Современные проблемы экологии» (Тула, 2007); Юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко (Москва, 2008); II Съезде микологов России (Москва, 2008); Международной научной конференции, посвященной 135-летию со дня И.И. Спрыгина (Пенза, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Мониторинг природных экосистем»

(Пенза, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в печатных изданиях перечня ВАК РФ.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно спланированы и осуществлены полевые и лабораторные исследования, проведены статистическая обработка и интерпретация данных полученных в результате выполнения диссертационной работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 174 источника, и приложений. Текст изложен на 135 страницах. Основная часть работы содержит 18 таблиц и 24 иллюстрации (диаграммы, рисунки, фотографии).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава состоит из пяти разделов, в которых рассматриваются дискуссионные вопросы значения некоторых химических элементов в физиологии и биохимии грибов. Освещается современное состояние проблемы биоабсорбции некоторых элементов базидиальными макромицетами, а также рассматриваются особенности накопления химических элементов грибами различных экологотрофических и таксономических групп. Обсуждаются описанные к настоящему моменту пути поступления химических элементов в базидиомы грибов. Анализируются возможности влияния химического состава питающего субстрата на накопление тяжелых металлов и других токсичных элементов плодовыми телами (Щеглов, Цветнова, 2002; Чураков и др., 2004; Demirba, 2002; Svoboda et al., 2006). Рассматривается значение в этом процессе эколого-трофической принадлежности. Оценивается зависимость накопления тяжелых металлов и других токсичных элементов от возраста мицелия и базидиом, возможности влияния различных химических элементов и органических соединений на накопление тяжелых металлов плодовыми телами макромицетов (Иванов, Блинохватов, 2003; Garca et al., 2007). Обсуждаются описанные в литературе механизмы детоксикации и депонирования избытка тяжелых металлов и мышьяка базидиальными макромицетами (Курченко и др., 2005; Wuilloud et al., 2004; Collin-Hansen et al., 2007). Рассматривается явление окислительного стресса (Челомин и др., 1998; Довженко и др., 2005; Рахмакулова, 2008; Hammel et al., 2002; Choundry, Panda, 2004), как главного биомаркера негативного влияния тяжелых металлов на живые организмы. В последнем разделе обзора описана современная прикладная проблема нормирования содержания тяжелых металлов и других токсичных элементов в плодовых телах съедобных грибов (Цапалова и др., 2002; Falandysz et al., 2002; Kala et al., 2004; Pelkonen et al., 2006).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в течение 3-х лет (2005-2008 гг.) на базе кафедры биологии и экологии Пензенской государственной сельскохозяйственной академии и Центральной экоаналитической лаборатории Регионального центра государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области. Объектами исследования были различные виды агарикоидных и гастероидных базидиомицетов. Сбор образцов осуществлялся в природных экосистемах Приволжской лесостепи в пределах Пензенской области, в основном в лесных экосистемах, приуроченных к серым лесным почвам и расположенных вдали от антропогенных источников поступления тяжелых металлов и урбанизированных зон. Изучение влияния антропогенной деятельности предполагало сбор образцов базидиом на загрязненных территориях: лесное сообщество, сформированное на золоотвале ТЭЦ г. Пенза; территории близ мест прежнего уничтожения химического оружия в окрестностях ст. Леонидовка Пензенского района (МПУ); лесополоса, расположенная вдоль оживленной автомагистрали М5 «Москва-Самара»

(в пределах 30 м от дорожного полотна). Всего было проанализировано 410 образцов, относящихся к 80 видам. Определение видов грибов проводили с использованием отечественных и зарубежных определителей (Сосин, 1973; Pilat, 1958; Phillips, 1981; Jlich, 1984; Moser, 1988; Rudnicka-Jezierska, 1991). Порядки и семейства приводятся по системе, приведенной на сайте Index Fungorum (CABI Databases, 2008). Номенклатура грибов принята и сверена по Index Fungorum (Index Fungorum search, 2008). Сокращения имен авторов даны в соответствии с «Authors of Fungal Names» (Kirk, Ansell, 1992). При изучении различий в элементном составе представителей различных эколого-трофических групп использовали шкалу А.Е. Коваленко (Коваленко, 1980).

Содержание изученных элементов в базидиомах и концентрацию валовых форм в почвах определяли рентгенофлуоресцентным методом. Подвижные формы тяжелых металлов и мышьяка в субстрате определяли атомноабсорбционным методом.

Выделение чистых культур для изучения влияния на их рост и развитие тяжелых металлов и мышьяка проводилось из плодовых тел грибов по методике Бухало (Бухало, 1988). Объектами исследований в данном случае служили следующие виды базидиальных макромицетов: Agaricus bitorquis (штаммы PZ-1, МА-2, МА5-1), Lycoperdon perlatum (штаммы ML5-1, LP-1, LP-2) и Flammulina velutipes (FV-9, FV-12, FV-16). Ионы металлов и мышьяка вносили в питательную среду (сусло-агар) до автоклавирования в виде водных растворов солей Pb(NO3)2, Na3AsO4 и Cr(CH3COOH)3 в концентрациях 0,5; 1,0 и 5,0 мМ. При изучении влияния тяжелых металлов и мышьяка на скорость роста мицелия использовались линейные методы измерения. Также отмечался такой временной параметр как длительность лаг-фазы (TL), характеризующий продолжительность адаптации мицелия грибов к обогащенным средам.

В процессе изучения влияния некоторых тяжелых металлов и мышьяка на биохимический статус клеток грибов использовался ряд гистохимических методов. Выявление пероксидазы проводили по реакции с гваяколом (Барыкина и др., 2000), присутствие супероксид-аниона по реакции с нитросиним тетразолием (Behera et al., 2004; Wang et al., 2005), выявление продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) проводили по реакции с диаминофлуореном по Фейгелю (Пирс, 1962). Микроскопические исследования проводились с использованием бинокулярного микроскопа «Ломо Микмед-1». В ходе работы велась фотодокументация с использованием цифрового фотоаппарата «Olympus – µ700».

Полученные данные были подвергнуты математико-статистической обработке с помощью пакета компьютерных программ «Excel 2003», «Statistica V5.5A».

3. ЗАКОНОМЕРНОСТИ БИОАБСОРБЦИИ НЕКОТОРЫХ

ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И МЫШЬЯКА ПЛОДОВЫМИ ТЕЛАМИ

БАЗИДИАЛЬНЫХ МАКРОМИЦЕТОВ

3.1. Накопление тяжелых металлов и мышьяка плодовыми телами, развивающимися в условиях экосистем, не испытывающих существенного Изучение содержания валовых и подвижных форм тяжелых металлов и мышьяка в почвах района исследований показало, что названный показатель отличался слабой изменчивостью и находился на уровне фоновых значений, характерных для региона (табл. 1). Четко выделяются виды, накапливающие в более высоких концентрациях тот или иной элемент, по сравнению с другими грибами, развивающимися в сходных условиях обитания.

Среднее содержание тяжелых металлов и мышьяка в серых лесных почвах Элемент Среднее содержание элементов, мг/кг воздушно-сухой Среднее содержание железа в базидиомах грибов составило 129,49 мг/кг воздушно-сухой массы. К видам, интенсивно аккумулирующим этот элемент можно отнести Amanita phalloides, Cortinarius triumphans, Lactarius quietus, Rozites caperatus, Russula ionochlora и Xerocomus subtomentosus в базидиомах которых средние концентрации составили 295,5; 300,5; 258,05; 281,75; 557,90 и 561,52 мг/кг соответственно. Средняя концентрация кобальта в плодовых телах составила 2,67 мг/кг воздушно-сухой массы. К видам, интенсивно накапливающим этот элемент можно отнести Amanita citrina, Boletus erythropus и Chalciporus piperatus в базидиомах которых средняя концентрация кобальта составила 4,12; 3,82 и 7,92 мг/кг соответственно. Максимальное содержание марганца обнаружено в базидиомах Panellus stipticus и составило 111,83 мг/кг воздушносухой массы. К группе биоаккумуляторов этого элемента также можно отнести Amanita rubescens, Cortinarius alboviolaceus, Lactarius rufus, Lycoperdon perlatum, Lepista flaccida, L. nebularis, L. nuda, Russula foetens, R. ionochlora, Suillus granulatus, в плодовых телах которых концентрация марганца была выше 25 мг/кг, при средней – 15,37 мг/кг. Выраженная способность к аккумуляции никеля отмечена для C. triumphans, Lactarius piperatus, Leucopaxillus giganteus, Russula delica и Macrolepiota procera, в базидиомах которых концентрация никеля составила 7,24; 6,82; 3,90; 4,16 и 4,55 мг/кг соответственно, при средней – 2,95 мг/кг.

Максимальное содержание свинца обнаружено в базидиомах Calvatia utriformis и составило 17,54 мг/кг воздушно-сухой массы. Также к группе биоаккумуляторов данного элемента можно отнести Boletus luridus, L. giganteus и L. perlatum, в плодовых телах которых концентрация свинца составила 7,96; 10,55 и 17, мг/кг соответственно, при средней – 2,47 мг/кг. К видам, проявляющим склонность к аккумуляции цинка можно отнести C. utriformis, Macrolepiota rhacodes, Lactarius deliciosus, Leccinum variicolor, L. perlatum. В плодовых телах этих видов концентрация цинка составила 159,10; 131,95; 138,25; 130,95; 150,8 мг/кг соответственно, при средней – 83,00 мг/кг. Способность к биоаккумуляции хрома отмечена для Amanita pantherina, A. phalloides, Boletus impolitus, Lactarius volemus, Russula adusta, R. delica, L. variicolor, Lepista saeva, L. giganteus. Содержание названного элемента в их плодовых телах превышало среднее в 2–3 раза и составило 1,38; 1,74; 3,01; 1,48; 1,35; 1,34; 1,32; 1,38; 1,50 мг/кг соответственно, тогда как в базидиомах других видов оно редко превышало 1,0 мг/кг. Максимальное содержание мышьяка обнаружено в базидиомах L. giganteus и составило 42,85 мг/кг воздушно-сухой массы. Выраженная способность к аккумуляции этого элемента также отмечена для Cortinarius aureoturbinatus, L. deliciosus, L.

perlatum, L. nuda и Tricholoma imbricatum, в плодовых телах которых концентрация мышьяка составила 22,90; 12,31; 27,01; 36,17 и 16,33 мг/кг воздушно-сухой массы соответственно. Средняя концентрация мышьяка в базидиомах составила 3,50 мг/кг.

Таким образом, изучение содержания тяжелых металлов и мышьяка в базидиомах грибов, собранных в условиях природных экосистем, не испытывающих существенного техногенного загрязнения, показало, что концентрация химических элементов сильно варьирует. В связи с тем, что изученные плодовые тела развивались в близких эдафических условиях, можно отметить, что главным фактором, определяющим величину и избирательный характер накопления тяжелых металлов и мышьяка, является комплекс биологических особенностей представителей разных видов.

3.2. Зависимость содержания тяжелых металлов и мышьяка в плодовых телах базидиомицетов от их концентрации в субстрате и возможности использования грибов в качестве биоиндикаторов Обнаружена статистически значимая корреляция между содержанием железа в базидиомах грибов и его концентрацией в субстрате для Lepista nuda и Russula xerampelina, кобальта – для Leccinum aurantiacum, свинца – для R. xerampelina и Lepista nebularis, цинка – для Lactarius citriolens и L. nebularis, хрома – для Macrolepiota procera, мышьяка – L. nuda (табл. 2). В некоторых случаях установлена отрицательная зависимость между содержанием элемента в базидиомах грибов и его концентрацией в субстрате. Так, выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между содержанием марганца в плодовых телах R. xerampelina и его концентрацией в субстрате.

Коэффициенты корреляции между содержанием тяжелых металлов и мышьяка в плодовых телах грибов и их концентрацией в субстрате