1

На правах рукописи

КОЛЕСНИКОВА

Ирина Станиславовна

РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫЙ «ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ» В

СОВМЕСТНОЙ КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ РАЗНОПОЛЫХ

ДОНОРОВ.

03.01.01 – радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012 2

Работа выполнена в лаборатории радиационной генетики Федерального государственного учреждения «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий Минздравсоцразвития» (ФГУ РНЦ РХТ Минздравсоцразвития), г. Санкт-Петербург

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор Воробцова Ирина Евгеньевна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Пелевина Ирина Ивановна; Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, руководитель лаборатории радиационной биофизики и экологии Кандидат биологических наук, доцент Спивак Ирина Михайловна; Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, старший научный сотрудник лаборатории радиационной цитологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Защита состоится « » 2012г. в час. на заседании диссертационного совета Д.501.001.65, Московский государственный университет им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, ауд. _.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Веселова Т.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы. Традиционно считали, что биологические эффекты ионизирующей радиации обусловлены только прямыми повреждениями молекул ДНК. Однако данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что в рамках классической «теории мишени» не всегда можно объяснить наблюдаемые медико-биологические последствия облучения, особенно при низких дозах лучевого воздействия. Ещё в 60-70х годах прошлого века было показано, что при относительно высоких дозах, кроме прямого механизма действия радиации на клетки, существует и опосредованный, называвшийся тогда дистанционным, гуморальным (Керкис и др, 1964; Zhumiel et al., 1971). Он выражался в том, что нарушения возникали не только в облучённых клетках, но и в гуморально связанных с ними интактных. Применительно к малым дозам ионизирующих излучений непрямой эффект радиации на клетки получил название радиационно-индуцированного «эффекта свидетеля» (РИЭС). Считается, что именно РИЭС может лежать в основе нестабильности генома потомства облучённых популяций клеток и организмов, радиационного канцерогенеза и неопухолевой отдалённой лучевой патологии при низкодозовом радиационном воздействии (Mothersill, Seymour, 2000). На основании большого количества экспериментальных данных были высказаны различные предположения о природе этих немишенных эффектов ионизирующих излучений.

Однако до сих пор конкретные механизмы, лежащие в основе РИЭС до конца не ясны.

Как правило, в работах по изучению РИЭС используются достаточно сложные методические приёмы: инкубирование необлучённых клеток в среде от облучённых (Mothersill et al, 2001), облучение культур клеток излучением с высокой ЛПЭ (Nagasawa, Little, 1992), внутреннее облучение клеток путём включения в них радиоактивных изотопов (Bishayee et al., 2001), трансплантация облучённых клеток костного мозга необлучённым реципиентам (Watson et al., 2000), облучение отдельных клеток микропучками заряженных частиц (Folkard et al., 1997; Folkard et al., 1997). Многие из них дорогостоящи и доступны лишь технически хорошо оснащённых лабораториям.

В связи с вышесказанным, продолжение исследования самого феномена РИЭС, а также поиск простых и доступных моделей для его выявления и изучения является актуальным.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении РИЭС на модели совместной культуры человеческих лимфоцитов разнополых доноров.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Исследовать возможность развития опосредованного адаптивного ответа (ОАО) по критерию хромосомных аберраций (ХА) в необлучённых лимфоцитах женских/мужских доноров при совместном культивировании с повреждающего воздействий G0 - G1.

Провести аналогичное исследование при временной схеме адаптирующего и повреждающего облучений G1 - G1.

3. Изучить взаимное влияние в совместной культуре облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов разнополых доноров на частоту спонтанных и индуцированных ХА.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе для исследования РИЭС был применён новый методический подход: совместное культивирование человеческих лимфоцитов периферической крови разнополых доноров. Кариотипическое различие мужских и женских клеток (XX и XY) даёт возможность раздельной регистрации генетических нарушений в облучённых лимфоцитах и в соседствующих с ними необлучённых. В настоящей работе РИЭС исследовали не только по морфологическому критерию (ХА), но и по одной из важных функциональных характеристик лимфоцитов – способности к адаптивному ответу. Было показано, что в необлучённых лимфоцитах при совместном культивировании с облучёнными в адаптирующей дозе клетками противоположного пола может развиваться адаптивный ответ по механизму «эффекта свидетеля».

Данные пилотного эксперимента по совместному культивированпию облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов, свидетельствующие о возможности не только негативного (мутагенного) влияния облучённых лимфоцитов на необлучённые, но и обратного, позитивного (антимутагенного) эффекта, являются новыми и представляют интерес в связи с практической клинической проблемой профилактики осложнений после лучевой терапии онкологических пациентов.

Теоретическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания роли немишенных механизмов в развитии отдалённой лучевой патологии у людей, подвергшихся действию ионизирующей радиации в малых дозах. Они позволяют также приблизиться к пониманию причин развития так называемых «вторичных» опухолей у пациентов после лучевой терапии первичных. Метод совместно культивирования лимфоцитов разнополых доноров, апробированный в работе на примере РИЭС по цитогенетическому критерию адаптивного ответа, теоретически может использоваться и для изучения других немишенных эффектов малых доз ионизирующей радиации (геномная нестабильность, повышение радиочувствительности).

Положения, выносимые на защиту 1. При совместном культивировании лимфоцитов, облучённых в адаптирующей дозе 0.05 Гр, и неадаптированных лимфоцитов после разрешающего облучения в дозе 1 Гр наблюдается адаптивный ответ по критерию ХА как в предварительно облучённых клетках, так и в необлучённых клеткахсвидетелях, при обеих использованных временных схемах адаптирующего и повреждающего воздействий (G0-G1 и G1-G1).

2. При совместном культивировании облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов наблюдается: в необлучённых клетках - повышение количества ХА по сравнению со спонтанным уровнем в монокультуре, в облучённых снижение количества индуцированных ХА по сравнению с аналогично облучённой монокультурой.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на международной научно-практической конференции «Отдалённые последствия воздействия ионизирующего излучения» (Киев, 2007); международной школеконференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», (Санкт-Петербург, 2007); научной конференции «От лучей рентгена – к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института» (Санкт-Петербург, 2008); V съезде ВОГиС (Москва, 2009);

международной конференции «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и загрязнение окружающей среды» (Сыктывкар, 2009); I Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); V международной научно-практической конференции "Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения" (Томск, 2010); VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) «25 лет с момента аварии на Чернобыльской АЭС» (Москва, 2010); конференции молодых ученых Санкт-Петербурга «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», (Санкт-Петербург, 2010); международной конференции «Медикобиологические проблемы действия радиации» (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ, и 10 тезисов съездов и конференций.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 4 рисунка. Список цитируемой литературы включает 205 источников, из них 148 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 1.1. Характеристика материала.

периферической крови 7 здоровых доноров (4 женского и 3 мужского пола) в возрасте от 19 до 32 лет, не имевших вредных привычек (табл.1).

Таблица 1. Поло-возрастная характеристика доноров.

Исследование «эффекта свидетеля» по критерию Исследование взаимного номера доноров В скобках указаны пол и возраст донора (годы) 1.2. Схемы экспериментов 1.2.1. Исследование «эффекта свидетеля» по критерию адаптивного ответа при временной схеме адаптирующего и повреждающего облучений G0-G В экспериментах по исследованию РИЭС по критерию адаптивного ответа с использованием временной схемы адаптирующего и повреждающего воздействий G0G1 кровь женского (№1, №3) либо мужского донора (№2, №4) облучали в адаптирующей дозе 0.05 Гр, культивировали совместно с интактными лимфоцитами донора противоположного пола в течение 5 часов, после чего культуру облучали в повреждающей дозе 1 Гр. На препаратах метафазных хромосом оценивали прямой (ПАО) и опосредованный (ОАО) адаптивный ответ по критерию частоты ХА.

Параллельно ставили смешанные культуры лимфоцитов, которые облучали только в повреждающей дозе 1 Гр на 5 часу культивирования для оценки исходной радиоустойчивости (РУ).

1.2.2. Исследование «эффекта свидетеля» по критерию адаптивного ответа при временной схеме адаптирующего и повреждающего облучений G1-G В экспериментах по исследованию РИЭС по критерию адаптивного ответа с использованием временной схемы адаптирующего и повреждающего воздействий G1G1 лимфоциты крови каждого из доноров (№3, №5 и №4, №6) культивировали раздельно в течение 24 часов, затем кровь одного из пары доноров облучали в адаптирующей дозе 0.05 Гр и культивировали совместно с лимфоцитами донора противоположного пола в течение 5 часов, на 29 часу культивирования совместную культуру облучали в повреждающей дозе 1 Гр. Параллельно ставили смешанные культуры лимфоцитов, которые облучали только в повреждающей дозе 1 Гр на часу культивирования.

1.2.3. Сопоставление количества индуцированных в лимфоцитах ХА в моно- и совместных культурах при временной схеме облучения G1-G1.

Для сопоставления количества индуцированных ХА в моно- и совместных культурах при временной схеме адаптирующего и повреждающего облучений G1-G кровь женского донора № 5 через 24 часа культивирования (стадия G1) облучали в адаптирующей дозе 0.05 Гр, после чего на 29 часу культивирования - в разрешающей дозе 1 Гр для оценки адаптивного ответа по частоте ХА в монокультуре. Параллельно ставили культуру необлучённых лимфоцитов этого же донора, которую облучали только в повреждающей дозе 1 Гр на 29 часу культивирования, для оценки исходной РУ по частоте ХА в монокультуре. Полученные после анализа препаратов результаты сравнивали с данными по оценке исходной РУ и ПАО женского донора №5 в смешанной культуре (п.1.2.2).

1.2.4. Исследование взаимного влияния необлучённых и облучённых в дозе 1 Гр лимфоцитов на частоту ХА.

В экспериментах по совместному культивированию облучённых в дозе 1 Гр и необлучённых лимфоцитов цельную кровь (лимфоциты G0) женского или мужского донора облучали в дозе 1 Гр, культивировали совместно с необлучённой кровью донора противоположного пола, после чего готовили хромосомные препараты.

Параллельно ставили монокультуры лимфоцитов обоих доноров, облучённых в дозе Гр для оценки их собственной РУ, а также необлучённых лимфоцитов обоих доноров для оценки спонтанного уровня ХА.

1.3. Облучение лимфоцитов.

Облучение цельной крови (лимфоциты G0) в адаптирующей дозе 0.05 Гр излучения Со60 проводили на аппарате Рокус-М в пластиковых пробирках «Эппендорф», помещённых в парафиновый контейнер, при мощности дозы 0. Гр/мин. Облучение культивируемых лимфоцитов в адаптирующей дозе 0.05 Гр на стадии G1 клеточного цикла проводили на рентгеновском аппарате РУМ-17 в бакпечатках, помещённых в парафиновый контейнер, при мощности дозы 0. Гр/мин. Облучение культур лимфоцитов в разрешающей дозе 1 Гр на ранней (5 часов культивирования) и поздней (29 часов культивирования) стадии G1 проводили на рентгеновском аппарате РУМ-17 в бакпечатках, помещённых в парафиновый контейнер, при мощности дозы 0.444 Гр/мин. Облучение цельной крови тормозным излучением в дозе 1 Гр проводили на линейном ускорителе электронов SL-75-5 в бакпечатках, помещённых в парафиновый контейнер, при мощности дозы 4. Гр/мин.

1.4. Приготовление метафазных препаратов лимфоцитов крови и микроскопический анализ препаратов.

Культивирование лимфоцитов крови осуществляли по стандартной методике (IAEA, 2001). Общее время культивирования во всех экспериментах составляло 48 ч.

Для гарантии учёта только тех клеток, которые находятся на стадии первого митотического деления, проводили FPG-окрашивание по методу, описанному (Kulka et al, 1995). Рутинный цитогенетический анализ выполняли на световых микроскопах «Микромед-1», «Бимам» (ЛОМО, Россия) и Axioplan (Carl Zeiss, Germany) в проходящем свете под масляной иммерсией при суммарном увеличении х1000. На препаратах смешанных и монокультур просматривали не менее 400-500 метафаз I пострадиационного митоза каждого пола для облучённых лимфоцитов и не менее 1000 метафаз I культурального митоза для необлучённых лимфоцитов, регистрируя на препаратах смешанных культур ХА раздельно в женских (ХХ) и мужских (ХY) клетках. Учитывали следующие типы ХА: дицентрические и кольцевые хромосомы, парные фрагменты (включая точечные двойные и кольцевые ацентрические фрагменты), одиночные фрагменты. Всего было проанализировано 20201 метафазных клеток.

1.5. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ GraphPad Prism и Statgraphics Plus 5.1. Для оценки достоверности различий между вариантами использовали t-критерий Стьюдента, а также его модификацию для серии парных сравнений, двухфакторный дисперсионный анализ и непараметрический парный критерий Вилкоксона. Выраженность адаптивного ответа рассчитывали следующим образом: для ПАО: ((РУ-ПАО)/РУ)*100%; для ОАО: ((РУОАО)/РУ)*100%.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Влияние облучения в дозе 0.05 Гр на развитие адаптивного ответа в облучённых (ПАО) и необлучённых (ОАО) лимфоцитах при совместном культивировании.

2.1.1. Временная схема адаптирующего и повреждающего облучений G0-G В таблице 2 представлены результаты экспериментов по исследованию РИЭС по критерию адаптивного ответа с использованием временной схемы адаптирующего и повреждающего воздействий G0-G1, выполненного на двух парах доноров.

В большинстве случаев частота индуцированных облучением в дозе 1 Гр ХА после предварительного адаптирующего облучения снижалась как в непосредственно предоблучённых лимфоцитах, так и в соседствовавших с ними. По общей частоте ХА достоверным ПАО оказался во всех 4 случаях. Достоверный ОАО был зарегистрирован в 2 случаях из 4 (у доноров №1 и №2). Снижение количества ХА по сравнению с исходной РУ при временной схеме G0-G1 как при ПАО, так и при ОАО для доноров, у которых он был достоверен, происходило в основном за счёт дицентрических хромосом. Достоверное снижение количества ацентрических парных фрагментов наблюдалось только при ОАО у одного донора донора (№1).

2.1.2. Временная схема адаптирующего и повреждающего облучений G1-G В таблице 3 представлены результаты исследования РИЭС по критерию адаптивного ответа с использованием временной схемы адаптирующего и повреждающего воздействий G1-G1, выполненного на двух парах доноров.

Во всех случаях общая частота индуцированных облучением в дозе 1 Гр ХА после предварительного адаптирующего облучения снижалась, в то же время достоверным ПАО оказался в 3 случаях из 4 (недостоверен у донора №6). Достоверный ОАО также был зарегистрирован в 3 случаях из 4 (недостоверен у донора №5). У донора № наблюдался достоверный ПАО при отсутствии достоверного ОАО по общему количеству ХА, хотя снижение количества парных и одиночных фрагментов при ОАО у данного донора было достоверным. У донора №6 не было выявлено ПАО, но наблюдался достоверный ОАО. Уменьшение уровня ХА в экспериментах с Таблица 2. Количество индуцированных ХА (1 Гр) в адаптированных (0.05 Гр) и неадаптированных женских/мужских лимфоцитах при их совместном культивировании с адаптированными/неадаптированными клетками донора противоположного пола при схеме облучений G0-G1.

* - отличие от соответствующего показателя для РУ достоверно (р 0.05, t-критерий Стьюдента).

Таблица 3. Количество индуцированных ХА (1 Гр) в адаптированных (0.05 Гр) и неадаптированных женских/мужских лимфоцитах при их совместном культивировании с адаптированными/неадаптированными клетками донора противоположного пола при схеме облучений G1-G1.

* - отличие от соответствующего показателя для РУ достоверно (р 0.05, t-критерий Стьюдента).

использованием временной схемы облучений G1-G1 как при ПАО, так и при ОАО происходило в основном за счёт сокращения количества ацентрических парных фрагментов. Достоверное снижение количества дицентрических хромосом наблюдалось только при ОАО у одного донора (№3).

2.1.3. Общий статистический анализ данных по всем донорам при обеих временных схемах адаптирующего и разрешающего облучений В 7 случаях из 8 при обеих временных схемах облучения (G0-G1 и G1-G1) наблюдался достоверный ПАО. Достоверный ОАО был зарегистрирован в 5 случаях из 8, ещё в 2 случаях он наблюдался как тенденция к снижению количества ХА (табл.

2, 3).

При обработке данных по всем донорам и обеим схемам облучения с помощью tкритерия Стьюдента для парных сравнений и непараметрического критерия Вилкоксона (Манна-Уитни) снижение общей частоты ХА в лимфоцитах как при непосредственном адаптирующем облучении, так и при совместном культивировании с адаптированными, оказалось достоверным (р < 0.05).

Был также проведён двухфакторный дисперсионный анализ (фактор А – наличие или отсутствие адаптирующего облучения, фактор В – временная схема облучений (G0-G1 или G1-G1)) индивидуальных результатов по всем донорам, который подтвердил влияние на частоту индуцированных ХА в лимфоцитах доноров предварительного низкодозового облучения лимфоцитов (для ОАО F = 4.42, p 0.05, для ПАО F=3.54, р=0.08). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности передачи сигнала к развитию адаптивного ответа от облучённых в адаптирующей дозе лимфоцитов мужского/женского донора клеткам-свидетелям.

Выявилось также достоверное влияние временной схемы адаптирующего и повреждающего воздействий на общее количество индуцированных ХА как при