На правах рукописи

КОКАНИНА АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО МЕТОДА

РЕКУЛЬТИВАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

03.02.08 – Экология (в химии и нефтехимии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук

Москва – 2012

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина и в лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им. Г.Ф.

Гаузе РАМН.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, Винокуров Владимир Арнольдович Научный руководитель: доктор биологических наук, Краснопольская Лариса Михайловна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой биотехнологии МГУ инженерной экологии, Бирюков Валентин Васильевич доктор технических наук, профессор кафедры промышленной экологии РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина, Мазлова Елена Алексеевна

Ведущая организация: Открытое Акционерное Общество «Всероссийский Научно-исследовательский Институт по Переработке Нефти»

(ОАО «ВНИИ НП»)

Защита диссертации состоится 26 июня 2012 г. в часов в аудитории 202 на заседании диссертационного совета Д 212.200.12 при Российском государственном университете нефти и газа имени И.М. Губкина по адресу:

119991, ГСП-1, г. Москва, Ленинский проспект, д. 65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного университета нефти и газа имени И. М. Губкина.

Автореферат разослан «_» мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат технических наук Иванова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Проблема разливов углеводородов нефтяного происхождения, в результате которых большие массы токсичных соединений попадают в почву и воду, занимает особое место. В России существует устойчивая тенденция к увеличению аварийности промышленных производств, связанных с переработкой углеводородного сырья или применением больших объемов растворителей на его основе, из-за несовершенства технологических процессов, изношенности оборудования, а также коррозии трубопроводных систем. По данным Международного социально-экологического союза, размеры утечек углеводородов на предприятиях нефтехимической, химической и нефтеперерабатывающей отраслей составляют от 1,5 до 11 % от объемов годовой добычи жидкого углеводородного сырья. Содержание углеводородов в почве на территориях ряда предприятий достигает 4 т/га, а в среднем составляет около 1,8 т/га.

При рекультивации загрязненных углеводородами почвенных экосистем применяются различные методы: физико-химические, механические, биологические. На биологическом этапе рекультивации и при низкой концентрации углеводородов в почве, не превышающей 5-20%, в зависимости от типа почвы, используются препараты на основе бактерий - или дрожжейдеструкторов углеводородов, или же происходит стимулирование почвенных микроорганизмов за счет введения питательных веществ в загрязненную систему.

Основной проблемой при использовании известных биопрепаратов для рекультивации загрязненных углеводородным сырьем почв является снижение численности или даже полная гибель внесенных микробных популяций.

Причинами этого могут быть вытеснение или выедание внесенных микроорганизмов местной почвенной микрофлорой, их вымывание из верхних почвенных горизонтов, неустойчивость углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) к ароматическим углеводородам.

Токсическое действие залпового характера углеводородов на местную микробиоту, а также накопление в почве токсичных соединений значительно углеводородокисляющий потенциал. Кроме того, важным негативным фактором являются низкие средние температуры основных промышленных регионов России, в особенности районов Восточной и Западной Сибири, где проблема углеводородного загрязнения почв стоит особенно остро. Это значительно ограничивает временной интервал активной работы известных биопрепаратов в процессе рекультивации.

В связи с этим большую актуальность для процессов рекультивации природных почвенных экосистем приобретает использование высших древоразрушающих грибов (базидиомицетов) как агентов-деструкторов углеводородов. Эти грибы способны вырабатывать широчайший спектр ферментов, расщепляющих такие сложные вещества, как, лигнин, целлюлоза, алканы, конденсированная ароматика, углеводороды других групп и т.д. В процессе роста они способны обеспечить доступ кислорода по почвенному профилю, что благоприятно сказывается на состоянии почвенной экосистемы и развитии флоры и фауны почвы, процессах восстановления экосистем после негативной техногенной нагрузки. Базидиомицеты, образуя консорциум с представителями аборигенной микробиоты почвы или УОМ промышленных биопрепаратов, способны усваивать чужеродные для живых организмов химические вещества (ксенобиотики), в том числе многочисленные токсичные соединения, не доступные для окисления другим группам организмов почвенной экосистемы. Кроме того, в составе указанных грибов содержится большое количество питательных веществ и микроэлементов, которые могут быть полезными для обитателей микробиоценоза почвы.

Эффективность исследуемых биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов для восстановления почвенных экосистем может быть значительно увеличена за счет объединения в одном препарате бактериальных и грибных организмов или продуктов их метаболизма. Более широкий температурный диапазон, в котором исследуемые грибные организмы сохраняют достаточно высокую активность (до 5-10оС) также способствует повышению эффективности биопрепаратов на их основе.

Таким образом, высшие нетоксигенные грибы, способные утилизировать широкий набор различающихся по химической природе субстратов и являющиеся источником разнообразных питательных веществ и микроэлементов, представляются весьма актуальными и перспективными объектами-деструкторами углеводородов в практике рекультивационных мероприятий загрязненных почв.

Цель работы и задачи исследования Основная цель данного исследования заключалась в разработке метода рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет совместного применения биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов и УОМ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести отбор видов и штаммов высших древоразрушающих грибов, способных колонизировать загрязненный углеводородами субстрат – потенциальных биодеструкторов углеводородов;

2. Разработать систему оценки и провести изучение способности отобранных объектов к деструкции углеводородов различной структуры;

3. Выявить аспекты взаимодействия между исследуемыми биодеструкторами нефтедеструктивный потенциал;

4. Провести оценку деструкции углеводородов при комплексном воздействии биодеструкторов и УОМ на ксенобиотики;

5. Оценить деструкцию углеводородов отобранными грибными биодеструкторами в условиях полевых испытаний.

Научная новизна Впервые установлено, что более интенсивное восстановление нефтезагрязненных почв за счет отобранных биодеструкторов вызвано спецификой их развития как на поверхности, так и в объёме загрязненного субстрата.

Показана возможность совместного применения исследованных грибных биодеструкторов и УОМ промышленного биопрепарата «Деворойл» с целью интенсификации процессов восстановления загрязненных почвенных экосистем.

Впервые установлена высокая устойчивость отобранных штаммов грибов к токсическому действию полиароматических углеводородов (ПАУ) в высокой концентрации (2 % масс.).

Практическая значимость Доказана эффективность окисления углеводородов отобранными биодеструкторами в условиях лабораторных и полевых испытаний. Натурные испытания показали, что биодеструкторы на основе исследуемых представителей высших древоразрушающих грибов могут являться основой для создания высокоэффективного комплексного биопрепарата для ликвидации разливов углеводородов и применяться в технологиях рекультивации почв как самостоятельные углеводородные биодеструкторы.

Результаты, полученные в данной работе, могут иметь значение как для проведения биологического этапа технологических работ по рекультивации загрязненных углеводородами почв, а также могут использоваться в качестве учебных материалов для чтения курса лекций по промышленной экологии:

«Охрана почв, рекультивация земель и утилизация отходов на предприятиях нефтепереработки, нефтехимии и газохимии», «Экологические проблемы нефте- и газопереработки и нефтехимии», «Промышленная экология».

Апробация работы Основные результаты исследований были представлены в докладах и презентациях на российских и зарубежных научных конференциях:

III Международная научная конференция «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 24-28 мая 2010г.); SPE Russian Oil and Gas Conference and Exhibition (October 26-28, 2010, Moscow); Вторая международная студенческая научная и практическая конференция «Нефтегазовые горизонты» (Москва, 6- декабря 2010г.); Первый Российский Нефтяной Конгресс (Москва, 14-16 марта 2011г); 65-ая международная студенческая научная конференция «Нефть и газ 2011» (Москва, 11-14 апреля 2011г.).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 2 тезиса докладов конференций и 3 доклада в сборниках материалов научно-технических конференций.

Структура и объем работы Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из аннотации, списка сокращений, введения, трех глав, заключения, списка использованной литературы, трех приложений. Библиография включает наименований 119, в том числе 33 иностранных источника. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 28 рисунками.

Работа посвящается памяти моей мамы Коканиной Анны Прокопьевны, которая подарила мне жизнь, была надежной опорой и поддержкой для меня каждую минуту своей жизни и сделала все, чтобы эта работа была завершена.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы целесообразность, перспективность и экологическая направленность в проведении исследований, связанных с технологиями рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет применения высших древоразрушающих грибных биодеструкторов, предложены возможные варианты их использования на биологическом этапе рекультивации почв.

Первая глава посвящена обзору современного состояния изучаемой проблемы, анализу результатов исследований в области биологического этапа рекультивации загрязненных углеводородами почв, а также роли грибных препаратов в процессах восстановления загрязненных ксенобиотиками почв.

Освещены данные статистики разливов углеводородов на территории Российской Федерации. Приведены методы восстановления загрязненных углеводородами почв и особенности их применения. Дана характеристика наиболее известных биопрепаратов для ликвидации разливов углеводородов.

Уделено внимание роли представителям высших древоразрушающих грибов как биодеструкторам углеводородов в процессах восстановления загрязненных углеводородами почвенных экосистем. Показано, что грибные древоразрушающие биодеструкторы обладают значительным потенциалом для применения их в практике рекультивации загрязненных углеводородами почв, поскольку в природных условиях используют лигнин (биополимер, имеющий в своем составе ароматические кольца) как источник углерода и энергии, а также способны деградировать широкий спектр поллютантов.

Деградация ксенобиотиков в природе под действием лигнолитических ферментов высших древоразрушающих грибов является процессом, интенсивное изучение которого, прежде всего, вызвано потребностями создания экологически безопасных технологий. Несмотря на то, что исследования деструкции ароматических соединений грибами, например, белой гнили, проводятся довольно давно, до настоящего времени сведения о древоразрушающими грибами в почве крайне ограничены.

Таким образом, принимая во внимание ситуацию в отрасли на сегодняшний день, ее потребности и изложенные выше положения, применение биодеструкторов на основе высших древоразрушающих грибов для восстановления почв, загрязненных углеводородами и углеводородными растворителями, представляется весьма перспективной и актуальной областью научных исследований.

Во второй главе приведено описание лабораторных установок, методик проведения экспериментальных исследований, применяемых методов анализа и обработки полученных результатов.

Объектами исследования выступали биодеструкторы на основе культур грибов класса базидиомцетов – группа высших древоразрушающих грибов (ксилотрофов), для которых характерным признаком является способность разрушать лигнин в процессе жизнедеятельности.

В качестве источников, содержащих УОМ, использовали промышленные биопрепараты для ликвидации нефтяных разливов «Родер» и «Деворойл».

Биопрепарат «Родер» состоит из двух штаммов-деструкторов углеводородов из рода Rhodococcus, не патогенных для животных, растений и человека.

Биопрепарат «Деворойл» представляет собой ассоциацию непатогенных штаммов УОМ, принадлежащих к родам Rhodococcus (3 штамма), Pseudomonas, Candida.

В качестве модельных ароматических углеводородов использовали нафталин, фенантрен, пирен, псевдокумол, а также смесь углеводородов в виде сырой туркменской нефти со следующим содержанием углеводородов во фракциях НК-200 °С: парафиновых — 50-60 %, нафтеновых — 26-33 %, ароматических — 11-20 %. Во фракциях, выкипающих выше 200 °С, содержание ароматики несколько выше. Относительная плотность нефти при 20 °С 420=0,864 г/мл.

В качестве моделей грунта, использовали кварцевый песок, рН сол.

вытяжки – 6,9; почву Московской области (рН сол. вытяжки 6,5); торфогрунт (содержание питательных элементов, мг/л, не менее: азот (NH4+NO3) – 150;

фосфор (P2O5) – 270; калий (K2O) – 300;) pH сол. вытяжки – 6,5; торфяную почву Западной Сибири, рН сол. вытяжки – 6,2.

Содержание нефтепродуктов в почве измеряли гравиметрическим методом нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим соответствии с ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 «Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложения методом ИКспектрометрии».

«Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природных и сточных вод методом колоночной хроматографии с гравиметрическим методом»; методом ИК-спектрофотометрии в соответствии с ПНД Ф 14.1:2646168-2000 (2004) «Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах Микроскопию грибных препаратов проводили методом световой фазовоконтрастной микроскопии.

Влияние экзометаболитов исследуемых биодеструкторов на культуры УОМ оценивали луночным методом по величине зоны задержки роста УОМ вокруг лунок с культуральными жидкостями грибных биодеструкторов.

Для проведения селективного отбора потенциальных биодеструкторов углеводородов культуры грибов выращивали на плотной питательной среде – глюкозо – картофельном агаре (ГКА). Для следующих экспериментов рабочий материал культуры биодеструкторов получали культивированием их в жидкой питательной среде состава, г/л: МgSO47H2O – 0,5; КН2РО4 – 1; глюкоза – 20;

мука пшеничная – 10; вода водопроводная– до 1000 мл. Среду стерилизовали в автоклаве при 120С в течение 1 часа. Твёрдофазное культивирование штаммов вели на соломе.

Контроль стерильности углеводородных сред осуществляли путём их посева на плотные питательные среды: ГКА и сусло-агар.

В третьей главе представлены результаты экспериментальных исследований по выявлению возможности совершенствования технологий рекультивации загрязненных углеводородами почв за счет применения исследуемых биодеструкторов.

В результате проведения селективного тестирования из имеющихся в коллекции грибов отобраны культуры, способные к росту на поверхности диагностического питательного субстрата на основе древесных опилок и углеводородных загрязнений в течение длительного промежутка времени.

Первый компонент отвечал известным пищевым потребностям культур грибов и обеспечивал тем самым поддержание их вегетативного роста в ходе эксперимента. Второй компонент представлял собой нефть известного состава.

В процессе эксперимента (14 суток при 27 С, аэробные условия) проводили визуальный контроль скорости роста, интенсивности развития культур базидиальных грибов и способности колонизировать нефтяное пятно в условных баллах: 1 – отсутствие роста на лигноцеллюлозном субстрате с нефтяным загрязнением; 2 – слабый рост на лигноцеллюлозном субстрате, отсутствие роста на нефтяном загрязнении; 3 – активное развитие на лигноцеллюлозном субстрате и медленный рост на нефтяном загрязнении; 4 – активное развитие на лигноцеллюлозном субстрате, развитие на части нефтяного пятна; 5 – интенсивное развитие с покрытием всей поверхности, заполненной нефтью.

Эксперимент выявил наиболее перспективные культуры грибов, которые быстро переходили с лигноцеллюлозного субстрата на нефтяное пятно и активно развивали на нем воздушный мицелий. Для дальнейших исследований из 15 были отобраны два штамма: T. versicolor (Биодеструктор-1) и F. pinicola (Биодеструктор-2).

Анализ отобранных грибных культур методом световой фазовоконтрастной микроскопии подтвердил наличие на их мицелии пряжек – микроморфологических структур, характерных для представителей базидиомицетов.

Таблица 1 – Динамика колонизации загрязненного углеводородами нефти субстрата исследуемыми биодеструкторами Pleurotus ostreatus Ganoderma lucidum Fomitopsis pinicola Trametes versicolor отобранные биодеструкторы в процессе жизнедеятельности способны использовать углеводороды нефти как единственный источник углерода и энергии. В качестве субстрата взяли прокаленный кварцевый песок, что исключило возможность использования как источника углерода органические соединения, которые могли бы присутствовать в субстрате. В подготовленный песок внесли источник углеводородов – нефть. В ходе эксперимента оценивали увеличение площади колоний исследуемых биодеструкторов в течение трех недель. Для этого поверхность крышек чашек Петри с внешней стороны разлиновали на квадраты со стороной 1 см. Каждые три дня оценивали прирост площади поверхности грунта, занятой биодеструктором. Структура эксперимента представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Структура эксперимента «Исследование способности грибных биодеструкторов использовать углеводороды нефти как источник углерода и энергии». Содержание нефти в системе – 5 % масс.

Увеличения площади, занятой Биодеструктором-2, в контроле не наблюдалось с 13 дня, в то время как в опыте он колонизировал новую поверхность до 16 дня включительно. Максимальная колонизированная биодеструктором в контроле площадь составила 7,2 балла. В опыте – 9, баллов. Разница между контролем и опытом составила 2,6 балла – рисунок 1: 1.

Рисунок 1 – Динамика роста базидиомицетов на прокаленном нефтезагрязненном песке: 1 – Биодеструктор-2; 2 – Биодеструктор- Увеличения площади, занятой Биодеструктором-1, в контроле не наблюдалось с 12 дня, в то время как в опыте он колонизировал новую поверхность до 18 дня включительно. Максимальная колонизированная биодеструктором в контроле площадь составила 7,9 балла, в опыте – 11 баллов.

Разница между контролем и опытом составила 3,1 балла (рисунок 1: 2).

Таким образом, из двух биодеструкторов максимальную активность проявил последний. Разница в активностях деструкторов незначительна.

Результаты эксперимента наглядно демонстрируют способность обоих биодеструкторов использовать углеводороды нефти как источник углерода.

Количественная оценка способности отобранных биодеструкторов утилизировать углеводороды в нефтезагрязненной почве (содержание нефти в почве 5 % масс.) показала, что углеводородокисляющая активность обоих объектов примерно одинакова как в стерильной почве, так и в присутствии аборигенной микробиоты. Эксперимент проводился на модельной системе в чашках Петри в течение 3 недель. Результаты анализа почвы на остаточное содержание углеводородов нефти через три недели экспозиции представлены на рисунках 2, 3.

Таблица 3 – Структура эксперимента «Количественная оценка утилизации углеводородов грибами в почве». Твердофазное культивирование Биодеструктор-1 Биодеструктор- Где П2 – почва; Н – нефть; БД – биодеструктор; С – солома.

Рисунок 2 – Изменение суммарного Рисунок 3 – Изменение суммарного экспериментальных образцах почвы. экспериментальных образцах почвы.

Разницы в нефтедеструктивной активности биодеструкторов не наблюдалось (рисунок 4). Это может свидетельствовать о том, что в нестерильной, изначально не загрязненной почве углеводородокисляющая микробиота сформирована не была за короткий промежуток времени. Однако факт высокой активности по отношению к утилизации углеводородов говорит о перспективности исследованных объектов как деструкторов углеводородов.

Рисунок 4 – Сравнительный анализ снижения углеводородов нефти в опытах с использованием отобранных биодеструкторов в различных условиях Эксперимент выявил, что рост биомассы отобранных биодеструкторов наблюдался как на поверхности, так и в объеме нефтезагрязненного субстрата, что можно наблюдать на рисунке 5. Описанный выше рост наблюдали для обоих образцов.

Рисунок 5 – Рост биомассы исследуемых биодеструкторов:

1 – по поверхности нефтезагрязненного субстрата, Количественная оценка способности исследуемых биодеструкторов утилизировать углеводороды нефти в условиях погруженного культивирования (суммарное содержание углеводородов в культуральной жидкости 1 % масс.) показала, что оба штамма проявляют активность и в данных условиях.

Эксперимент проводился на модельной системе в колбах на ротационной качалке 2 недели. Результаты анализа остаточного содержания углеводородов нефти в жидкой фазе через две недели экспозиции представлены на рисунке 6.

Рисунок 6 – Изменение суммарного Рисунок 7 – Снижение содержания содержания углеводородов в углеводородов нефти в опытах с экспериментальных образцах. использованием отобранных Погруженное культивирование биодеструкторов. Погруженное Деструкция углеводородов нефти в контрольном образце составила 27,4 %.

Биодеструктором-1 составило 59,1 % по отношению к начальному содержанию углеводородов. Для экспериментального образца с Биодеструктором-2 это значение составляет 56,5 % соответственно. В этом эксперименте углеводородокисляющая активность Биодеструктора-1 была выше. Аналогичная тенденция наблюдалась и во всех предыдущих опытах.

Существенным источником поступления ПАУ в окружающую среду являются разливы углеводородов нефти и ароматических растворителей, при этом ПАУ могут накапливаться в экосистеме, поскольку очень важную роль играет их стабилизация в адсорбированном состоянии в почвах. Содержание ПАУ в окружающей среде может достигать опасного для живых организмов уровня, в том числе и для человека. Благоприятные условия для разложения ПАУ микроорганизмами создаются в присутствии кислорода, относительно высоких температурах и достаточном количестве питательных веществ.

Исследование устойчивости грибных биодеструкторов и УОМ к действию полиароматических углеводородов (ПАУ) (концентрация ПАУ в системе 2 % масс.) показало, что грибы проявляют высокую устойчивость к их токсичному действию, в то время как для углеводородокисляющей микробиоты биопрепаратов «Родер» и «Деворойл» данное свойство не замечено.

Эксперимент проводили на модельной системе (почвогрунт: песок = 1:1 по массе) пластиковых контейнерах, навеска почвы 400 г. Модельный раствор ПАУ готовился путем растворения 50 % масс. смеси нафталина, фенантрена и пирена в равной массовой концентрации в псевдокумоле. Этот раствор в количестве 4% масс. добавляли к модельной почвенной смеси и равномерно перемешивали.

По истечении 30 суток с момента постановки опыта ни в опытных образцах, где в роли деструкторов углеводородов выступали УОМ промышленных биопрепаратов, ни в контрольных образцах почвы микробных форм жизни обнаружено не было. При использовании исследуемых грибных биодеструкторов была зафиксирована структура (поперечная пряжка), характерная для представителей класса базидиомицетов, что можно проследить на рисунке 8.

Рисунок 8 – Микрофотография Рисунок 9 – Внешний вид Биодеструктора-1. Световая экспериментального образца почвы.

микроскопия, фазовый контраст (Х400) Биодеструктор- Экспозиция – 30 суток Отбор пробы – 30-е сутки эксперимента В ходе исследования также был отмечен рост биомассы деструкторов на поверхности почвы после рыхления и перемешивания почвенных образцов (поднятие на поверхность глубинных слоев почвы), что можно увидеть на рисунке 9. Это еще раз подтверждает способность грибных биодеструкторов осуществлять жизнедеятельность не только по поверхности, но и в объеме нефтезагрязненного субстрата и возможности создания благоприятных условий для развития и жизнедеятельности нефтеокисляющих микроорганизмов.

Рисунок 10 – Адгезия УОМ биопрепарата «Деворойл» на поверхности 1 – чистый препарат «Деворойл»; 2 – Биодеструктор-1 и препарат «Деворойл»

Световая микроскопия, фазовый контраст (Х400) С целью изучения взаимодействия друг на друга потенциальных компонентов биопрепаратов для ликвидации разливов углеводородов исследовали адгезию УОМ биопрепаратов «Деворойл» и «Родер» на поверхности грибного биодеструктора. Установлено, что УОМ с теми же морфологическими характеристиками, что и в суспензии биопрепарата, фиксируются на поверхности грибного биодеструктора (рисунок 10).

Рисунок 11 – Адгезия УОМ биопрепарата «Родер» на поверхности грибного 1 – чистый препарат «Родер»; 2 – Биодеструктор-1 и препарат «Родер»

Световая микроскопия, фазовый контраст (Х400) морфологических форм, являющиеся составляющей биопрепарата «Родер», также были способны прикрепляться к поверхности биодеструктора (рисунок 11).

Отмечено, что адгезированные УОМ продолжали делиться (рисунок 12).

Это говорит о том, что соответствующие окружающие условия и среда микроорганизмов. Данный факт подтверждает возможность создания комплексной технологии для ликвидации разливов углеводородов нефти и растворителей на их основе с использованием исследуемых грибных биодеструкторов. Явление адгезии обеспечит эффективное распространение УОМ в объеме почвы благодаря активно растущей биомассе деструкторов углеводородов по почвенному профилю. Проникая вглубь почвы, она создаст углеводородокисляющей микробиоты. Это явление, с одной стороны, увеличивает интенсивность биодеградации углеводородов нефти в объеме грунта, а с другой – создает благоприятные условия для процесса восстановления биоценоза почвы в целом.

Рисунок 12 – Деление адгезированных Рисунок 13 – Влияние метаболитов УОМ препарата «Деворойл» на биодеструкторов на УОМ (препарат поверхности Биодеструктора-1. «Деворойл») Известно, что грибы способны продуцировать антибиотические вещества, обладающие специфичностью действия к чувствительным к ним культурам микроорганизмов. Установление специфики влияния продуктов жизнедеятельности отобранных грибных биодеструкторов на УОМ промышленных биопрепаратов и возможности их объединения в одном препарате с целью повышения интенсивности процессов восстановления загрязненных углеводородами почв показало следующие результаты.

(рисунок 13). Фильтрат культуральной жидкости Биодеструктора-1 проявлял антибиотическую активность в отношении УОМ биопрепарата. Однако, незначительный диаметр зоны угнетения роста, не превышающий 10 мм, свидетельствует о возможности использования данного биодеструктора вместе с УОМ биопрепарата для деструкции углеводородов.

жизнедеятельности многих грибов бактерии способны активизировать свои метаболические процессы, в том числе ферментативную деятельность.

Эксперимент, направленный на определение возможности утилизации культивирования.

Изучение накопления биомассы исследуемых биодеструкторов показало, что ее выход увеличивается при внесении в питательную среду углеводородов нефти. В контрольных точках показатель роста биомассы в колбах с биодеструктором и углеводородами нефти (содержание в системе 1 % масс.) превышал его аналогичное значение в опыте без углеводородов, что косвенным образом свидетельствует о том, что грибы использовали углеводороды в качестве источника питания. В то же время было установлено, что присутствие УОМ затормаживало прирост биомассы биодеструкторов по сравнению с его приростом в точках контроля в аналогичных опытах в отсутствии УОМ.

(рисунок 14: 1,2).

Этот факт свидетельствует о том, что оба компонента конкурируют за доступный питательный субстрат, в том числе углеводороды нефти. Многие более устойчивые к окислению алканы, циклоалканы и голоядерные ароматические углеводороды в виде моносубстратов не потребляются микроорганизмами, а разлагаются в режиме со-окисления с другими более доступными углеводородами.

Рисунок 14 – Динамика накопления биомассы грибами в присутствии УОМ препарата «Деворойл»: 1 – Биодеструктор-1; 2 – Биодеструктор- Таким образом, можно предположить, что в данном случае имеет место конкуренция за доступный питательный субстрат в начале эксперимента с последующей адаптацией деструкторов углеводородов к условиям среды посредством установления «выгодной» стратегии использования источника питания: грибы, обладая мощной ферментной системой, трансформируют менее доступные для УОМ углеводороды в более привлекательные с точки зрения способности УОМ к их окислению. Данное предположение подтверждают результаты, полученные в следующих экспериментах.

Выявлен синергетический эффект при утилизации углеводородов УОМ и грибными биодеструкторами в условиях погруженного культивирования (содержание углеводородов в системе 1 % масс.). Несмотря на условия конкуренции между двумя компонентами-деструкторами углеводородов за питательный субстрат, наибольшее значение биодеструкции углеводородов было замечено в опыте с их совместным культивированием. Контролем в этой серии экспериментов служила стерильная нефть без добавления нефтеокисляющих агентов. Контроль был выполнен в двух вариантах: при постоянном перемешивании и в стационарных условиях, при этом разница в уровне естественной убыли нефти выявлена не была. Активность обоих исследуемых биодеструкторов зафиксирована на достаточно высоком уровне.

Анализ на остаточное содержание углеводородов в системе проводили гравиметрическим методом (рисунок 15: 1,2).

Рисунок 15 – Динамика снижения содержания углеводородов нефти в системе под воздействием изучаемых биодеструкторов. Жидкофазное культивирование.

Максимальный эффект по снижению содержания углеводородов нефти в культуральной жидкости наблюдается когда на загрязненный субстрат воздействуют деструкторы различного происхождения – грибной и УОМ биопрепарата «Деворойл». Для Биодеструктора-1(БД-1) это значение достигает 74,3 %, в случае Биодеструктора-2 (БД-2) деструкция нефти при синергетическом воздействии составила 71,2 %. Когда деструкторы работали самостоятельно, снижение нефти в почве в опыте для Биодеструктора- составило 51,3 %, для Биодеструктора-2 – 47,4 %, для биопрепарата «Деворойл» – 62,0 % соответственно. Тенденция отображена на рисунке 16.

Рисунок 16 – Сравнительный анализ деструкции углеводородов нефти в опытах с использованием отобранных биодеструкторов и УОМ. Погруженное Таким образом, совместное применение грибных биодеструкторов и УОМ препарата «Деворойл» обеспечило более активную утилизацию углеводородов нефти, несмотря на снижение биомассы исследуемых биодеструкторов.

Возможно, этот факт следует рассматривать, как предпосылку для снижения нагрузки на естественную микробиоту почвы при обработке ее известными нефтеокисляющими биопрепаратами.

Для проведения полевых испытаний был получен опытный образец биопрепарата на основе Биодеструктора-1, показавшего наибольшую активность в лабораторных исследованиях. Для получения биопрепарата биодеструктор получали на лигноцеллюлозном субстрате в полипропиленовых пакетах, снабженных фильтром.

Испытания биопрепарата проводили в летний период 2011 года на нефтезагрязненном участке Ватинского месторождения, ХМАО в течение трех недель. Расход биопрепарата составил 125 г/м2 почвы при его влажности 74 %.

Среднесуточная температура окружающего воздуха в течение времени проведения эксперимента составляла 20-22 °С. Результаты, полученные в ходе проведения испытания, приведены в таблице 4 и на рисунке 17.

Таблица 4 – Изменение содержания углеводородов нефти в почвенных Рисунок 17 – Изменение содержания углеводородов на экспериментальном участке на момент окончания эксперимента Сохранение высокой нефтеокисляющей активности биодеструкторов при содержании нефтепродуктов в почвенной экосистеме на уровне 5 % массовых, и эффективное их окисление за 3 недели экспериментальных работ говорит о том, что исследуемые биодеструкторы могут применяться для ликвидации разливов углеводородов как самостоятельно, так и в комплексе с УОМ.

Применение лигноцеллюлозных материалов (солома, опилки) в качестве ростового субстрата для грибных биодеструкторов положительно влияет на процессы восстановления почвенных экосистем, а так же позволяет решить вопросы утилизации лигноцеллюлозсодержащих отходов промышленности.

Вместе с тем, комплексное решение проблем восстановления почвенных угнетающему воздействию чужеродных агентов: как ростовой субстрат деструктора, так и сам деструктор представляют собой часть почвенного ценоза.

В заключении представлены выводы по проведенным исследованиям, оценка полноты решения поставленных задач и предложения по дальнейшему использованию результатов диссертации.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Разработан комплексный метод рекультивации нефтезагрязненных почв с использованием базидиальных грибов, утилизирующих углеводородные загрязнения.

Предложен селективный метод определения активности базидальных грибов, колонизирующих углеводородные загрязнения, выделены наиболее (Биодеструктор-2), способные использовать в качестве единственного источника углерода углеводороды нефти.

Количественно оценена степень разложения углеводородов нефти биодеструкторами на основе грибов в стерильной и нестерильной почве.

Эффективность очистки Биодеструктором-1 составила 58 % в стерильной и 56 % в нестерильной почве за три недели эксперимента. Для Биодеструктораэти показатели составили 46 % и 44 %, соответственно.

Доказано, что совместное применение биодеструкторов и промышленного восстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем, продукты углеводородокисляющие микроорганизмы.

Показан синергетический эффект при совместном применении исследуемых углеводородов нефти в условиях погруженного культивирования. Сравнение эффективности применения биодеструкторов и комплекса биодеструкторУОМ показало увеличение деструкции углеводородов нефти за 9 суток эксперимента от 51,3 до 74,3 % для Биодеструктора-1 и от 47,4 до71,2 % – для Биодеструктора-2.

Влияние полиароматических соединений на исследуемые грибные биодеструкторы, в отличие от промышленных микробных биопрепаратов, незначительно, они способны активно развиваться в почве с содержанием полиароматических углеводородов до 2 % масс.

Определено, что Биодеструктор-1 сохраняет высокую нефтедеструктивную активность в условиях полевых испытаний Ватинского месторождения (Западная Сибирь) при содержании углеводородов нефти в почве 5 % массовых: деструкция углеводородов нефти в системе под воздействием биопрепарата на его основе составляет 54,2 % за 3 недели.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Винокуров В.А., Ботвинко И.В., Барков А.В., Сребняк Е.А., Фролова М.А., Никитин Д.А., Стексова Е.В., Панкратова М.А., Коканина А.В., Арапов К.А., Татаринов А.М., Новиков А.А., Котелев М.С., Бородина О.М., Чжан Данянь.

Биотехнологические альтернативы традиционным технологиям в нефтегазовой отрасли // Труды РГУ нефти и газа имени И.М. Губкина. – 2009. – №2(255) – С.45-57.

2. Заявка на получение патента РФ. Штамм гриба Fomitopsis Pinicola (Sw.; Fr.) P.Karst. INA 01068, обладающий способностью к деструкции углеводородов нефти и биоремедиации нефтезагрязненных почв, способ получения его биомассы и биомасса гриба. Краснопольская Л.М., Автономова А.В., Леонтьева М.И., Барков А.В., Винокуров В.А., Новиков А.А., Коканина А.В. // Заявка № 2010138985. Заявлено 22.09.2010. (По данным на 23.05. состояние делопроизводства: экспертиза по существу) 3. А.В. Коканина, М.Ю. Марченко, А.В. Барков, М.И. Леонтьева, А.В.

Автономова, В.А. Винокуров, Л.М. Краснопольская. Возможности использования базидиальных грибов с целью повышения эффективности рекультивации нефтезагрязненных почв // Башкирский химический журнал. – 2010 – Том 17 – №3 – C. 123-129.

А.В. Барков, М.И. Леонтьева, Е.А. Некрасова, А.В. Савин, А.В. Коканина, Л.М. Краснопольская. Микобиотехнологический метод утилизации отходов производства биоэтанола // Башкирский химический журнал. – 2010 – Том 17 – №3 – C. 130-135.

Ивасишин П.Л., Марютина Т.А., Коканина А.В., Савонина Е.Ю.

Эффективность использования биопрепаратов, сорбентов, гуматов при рекультивации участков Самотлорского месторождения // III Международная научная конференция «Современные проблемы загрязнения почв»: Сборник материалов, 24-28 мая 2010г. – М.: МГУ – 2010 – C. 512.

A.V. Kokanina, M.I. Leont'yeva, A.V. Barkov, L.M. Krasnopolskaya, V.A.

Vinokurov. Possibility of Using Basidiomycetes for Enhancing Efficiency of Oilcontaminated Land Recultivation // SPE Russian Oil and Gas Conference and Exhibition, October 26-28, 2010, Moscow, Russia.

SPE Library Paper 138082-MS. Possibility of Using Basidiomycetes for Enhancing Efficiency of Oil-contaminated Land Recultivation. Digital object identifier 10.2118/138082-MS.

А.В. Коканина, В.А. Винокуров. Новый подход к рекультивации нефтезагрязненных почв за счет применения базидиальных грибов // Вторая международная студенческая научная и практическая конференция «Нефтегазовые горизонты»: Сборник материалов, 6-7 декабря 2010г. – М.:

РГУНГ имени И.М. Губкина – 2010 – С.211 (Третье место).

Коканина А.В., Барков А.В., Краснопольская Л.М., Винокуров В.А. Новые технологические решения в процессах рекультивации нефтезагрязненных почв. // Первый российский нефтяной конгресс: Сборник материалов, 14- марта 2011г. – г. Москва, 2011 – С. 228-231 (Диплом за активное участие в работе конгресса).

А.В. Коканина, А.В. Барков, Л.М. Краснопольская, В.А. Винокуров.

Восстановление нефтезагрязненных почв: комплексный подход к решению задач повышения эффективности процессов // 65-я международная студенческая научная конференция «Нефть и газ 2011»: Сборник тезисов, 11апреля 2011г. – М.: РГУНГ имени И.М. Губкина – 2011 – С.8 (Диплом лауреата).

Благодарю своих дедушку Каракчиева П.С. (ветеран ВОВ, разведчик Калининского фронта) и бабушку Каракчиеву Н.В. (ветеран ВОВ, зенитчица Мурманского фронта) за то, что я могу жить и работать под мирным небом над головой.

Благодарю родных, друзей и близких за поддержку.

Благодарю всех, кто принимал участие в работе, за поддержку и ценные советы.

Разработка комплексного метода рекультивации нефтезагрязненных почв Подписано в печать 24.05.2012. Формат 60х84 1/16.

Печать трафаретная. Уч.-изд. л. Объём 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 7401.