На правах рукописи

Киселев Евгений Геннадьевич

ТЕХНИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОСИНТЕЗА

РЕЗЕРВНЫХ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ

ВОДОРОДНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Красноярск-2012 2

Работа выполнена в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН и базовой кафедре биотехнологии ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Волова Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты:

Величко Надежда Александровна, доктор технических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», институт пищевых производств, директор Литовка Юлия Александровна, кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», доцент кафедры химической технологии древесины и биотехнологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт химии и химической технологии Сибирского отделения Российской академии наук»

Защита состоится «» 2012 года в ч на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 при ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82, аудитория Ц-110 (зал заседаний).

Отзывы на автореферат в двух экземплярах с подписями, заверенными печатью, просим направлять по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира 82, Сибирский государственный технологический университет, учёному секретарю.

E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «_» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук, профессор Исаева Елена Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биотехнологические процессы обеспечивают производство широкого спектра целевых продуктов медицинского, пищевого, кормового, и технического назначения. Ценным продуктом биотехнологии являются макромолекулы запасной природы – полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (полигидроксиалканоаты) – термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы. Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с тем, что объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн.

тонн в год; основная их часть скапливается на свалках и аккумулируется в Мировом океане, создавая глобальную экологическую проблему. Острота проблемы связана также с экономической ситуацией, так как до 98 % полимерных материалов производится из невозобновляемого ископаемого сырья – нефти и газа, запасы которых истощаются.

В настоящее время все большее значение приобретают экологически чистые материалы, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (так называемые биополимеры). Фундаментальные исследования потенциала биологических агентов и биосистем, ориентированные на получение научной основы для развития индустрии экологически чистых полимерных материалов - актуальное и высокорейтинговое направление критических технологий мирового уровня. Освоение биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров;

получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.

Среди применяемых и активно разрабатываемых новых биоразрушающихся полимеров, наряду с полилактидами, полигидроксиалканоаты (ПГА). Эти полимеры активно исследуются за рубежом; в сфере коммерциализации ПГА заняты многие фирмы и промышленные компании («Монсанто К°», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambel» и др.). В России индустрия разрушаемых полимеров не создана;

исследования, направленные на разработку биотехнологических процессов синтеза собственно ПГА – в сфере внимания нескольких академических институтов (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институт биофизики СО РАН).

Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 40-50 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.

Одними из перспективных продуцентов ПГА являются водородокисляющие бактерии, обладающие способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях СО2 и Н2 и также на органических субстратах (Заварзин, 1979; Шабанов с соавт., 2005). Исследование закономерностей синтеза ПГА на различных субстратах, проведение сравнительной оценка эффективности технологических режимов необходимы для разработки эффективных технологий получения этих ценных макромолекул. Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение техникоэкономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.

Цель и задачи исследования: Разработка технико-технологических характеристик процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов водородными бактериями на различных субстратах в качестве основы для разработки технологии их получения.

Для достижения цели сформулированы следующие задачи:

- изучение кинетических и продукционных показателей бактерий Сupriavidus eutrophus в лабораторных условиях с использованием автотрофного (смеси Н2, СО2 и О2) и гетеротрофного (глюкоза) субстратов;

- исследование и отработка режимов (хемостатного, периодического, проточнопериодического) выращивания бактерий на смеси Н2, СО2 и О2 для повышения выходов ПГА и сокращения длительности процесса;

- изучение влияния физиологической активности инокулята, исходной концентрации клеток в инокуляте на продуктивность синтеза ПГА культурой С. eutrophus на глюкозе;

- разработка и реализация режимов культивирования бактерий С. eutrophus для получения ПГА, различающихся составом мономеров;

- сравнительный анализ методов экстракции ПГА с применением различных реагентов - технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах;

- получение исходных данных и разработка технологии производства ПГА.

Научная новизна: Исследована культура бактерии С. eutrophus в различных режимах выращивания; получены новые данные о закономерностях синтеза полигидроксиалканоатов, составившие основу для разработки технологии их получения. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры в условиях автотрофного (смеси Н2, СО2 и О2) и гетеротрофного (глюкоза) питания; определены затраты субстратов на образование ПГА и эффективность их использования. Установлены оптимальные для условия биосинтеза: исходная концентрация и физиологическая активность инокулята, режимы подачи лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего внутриклеточную аккумуляцию ПГА. Это позволило разработать хемостатнопериодические режимы синтеза ПГА в автотрофном и гетеротрофном, режимах. Изменение режима углеродного питания, заключающегося в регламентированной подаче в культуру второго углеродного субстрата (валерата, гексаноата, -бутиролактона), позволило разработать и реализовать технологию получения полимеров, различающихся физико-химическими свойствами. На основании сравнительного исследования режимов экстракции ПГА из биомассы с применением растворителей и поверхностноактивных веществ предложены методы, обеспечивающие полноту извлечения полимера свыше 96 % без существенного изменения молекулярно-массовых характеристик различной чистоты.

Практическая значимость: Выполнен сравнительный технико-экономический анализ лабораторных процессов синтеза ПГА культурой С. eutrophus при различных субстратных сценариях. На основе полученных экспериментальных результатов культивирования бактерий на глюкозе разработана технология, позволяющая повысить выход продукта более, чем в два раза. Технология опытного производства полимеров (ПГА) реализована в проекте «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов».

Положения, выносимые на защиту: В рамках специальности 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнология) (п.3 – изучение и разработка технологических режимов выращивания микроорганизмов-продуцентов направленного биосинтеза биоразрушаемых полимеров, изучение их состава, техникоэкономических критериев оценки; п.4 – изучение и разработка процессов сгущения биомассы, экстракции выделения, фракционирования, очистки контроля целевых продуктов) на защиту выносится:

- кинетические и продукционные характеристики хемостатной и периодической культуры Сupriavidus eutrophus, выращиваемой в автотрофных (СО2:О2:Н2) и гетеротрофных (глюкоза) условиях питания, на основе которых разработаны режимы культивирования с содержанием ПГА, соответственно, (75±5) и (85±5) % при достигнутых урожаях биомассы до 50 и 110 г/л;

- результаты сравнительного исследования методов экстракции ПГА из биомассы бактерий и предложенные методы, обеспечивающие более полное извлечение полимера из биомассы бактерий (96 %) для различных областей применения;

- технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах; технология синтеза полимеров на глюкозе.

Работа выполнена в рамках плановой тематики ИБФ СО РАН (государственная регистрация № 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии СФУ в рамках инновационного проекта «Организация производства разрушаемых биополимеров и изделий из них на новых субстратах, продуктах переработки низкосортных углей» (проект № 31 2008 г.); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы» (2008-2011 г.г. проект РНП-11); проекта ККФНПДиНД «Создание GMP пилотного производства разрушаемых биопластиков «Биопластотан» ( г.); мега-грантов по Постановлению Правительства РФ от 9.04.2010 г., № 219 «Развитие системы инфраструктурной поддержки исследовательской, инновационной и образовательной деятельности, а так же инновационных проектов и комплексных программ на приоритетных направлениях научно-технического развития, реализуемых по инициативе СФУ на базе технологических платформ» (договор № 13.G38.31. 0009) и № 220 «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор № 11G34.31.0013).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, 2012); «Лесной и химический комплексы – проблемы и решения» (Красноярск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в т.ч. 1 статья в специализированном журнале перечня ВАК.

Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов по исследованию кинетических и продукционных характеристик культуры, способам экстракции полимеров; обработка и анализ результатов, выполнение ТЭО процесса, участие в проектировании опытного производства полимеров; подготовка публикаций.

Структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 19 таблиц, 31 рисунок, 3 приложения; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и их обсуждение (5 глав), заключение, выводы. Список цитируемой литературы включает 149 источников, в т.ч.

114 зарубежных.

Содержание работы Во введении обоснована актуальность работы и ее вклад в решение проблемы создания научной основы для биотехнологического производства материалов нового поколения – разрушаемых полиэфиров гидрокисалкановых кислот (полигидроксиалканоатов).

В первой главе – литературном обзоре – представлен анализ литературы по проблеме поиска альтернативных экологически безопасных технологий синтеза экологически чистых материалов нового поколения взамен аккумулируемым в природе синтетическим полимерам. Рассмотрены продуценты, субстраты и биотехнологические способы синтеза ПГА продуцентами различных таксонов на индивидуальных соединениях и отходах; свойства и потенциал этих биополимеров. Охарактеризованы современные масштабы производства ПГА и области применения. Проанализированы и выделены ключевые факторы, влияющие на технико-экономические показатели производства и стоимость полимеров этого класса. В заключительном разделе представлен анализ потенциала водородокисляющих микроорганизмов, способных к синтезу ПГА на различных субстратах.

Во второй главе описаны объекты и методы исследования. Исследован штамм водородокисляющих бактерий, зарегистрированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов: Cupriavidus eutrophus В-10646 (прежнее систематическое название Ralstonia eutrophus), обладающий устойчивостью к -буторолактону, солям алкановых кислот и характеризующийся способностью к синтезу ПГА различного химического строения в автотрофных и гетеротрофных условиях. Для выращивания бактерий за основу принята солевая среда Шлегеля (Schlegel, 1961). При автотрофном культивировании в качестве основного ростового субстрата использовали газовую смесь в соотношении CO2 : O2: H2 = 1 : 2 : 7 по объёму; при гетеротрофном – глюкозу.

Для процессов культивирования использовалось следующие оборудование:

шейкер-инкубатор Innova 44, автоматизированные ферментационные комплексы BioFlo 115 «New Brunswick Scientific» (США), самостерилизуемый ферментером NLF фирмы «Bioengineering» (Швейцария). Внутриклеточную концентрацию ПГА, остаточных липидов и жирных кислот определяли на хромато-масс-спектрометре «Agilent 7820»; молекулярную массу ПГА – с использованием системы гель-проникающей хроматографии «Agilent 1200». Рентгеноструктурный анализ и определение степени кристалличности образцов ПГА выполнены на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE «Bruker» (Германия). Термические свойства исследованы методом ДСК с использованием прибора фирмы «NETZCH» (Германия).

В третьей, четвертой и пятой главах – обсуждение результатов.

1 Кинетические и продукционные характеристики автотрофной культуры водородокисляющих бактерий Cupriavidus eutrophus в режиме синтеза резервных полигидроксилаканоатов В связи с тем, что ПГА синтезируются при несбалансированном росте и используются клетками в качестве эндогенного депо энергии и углерода, получение высоких выходов по биомассе с высоким внутриклеточным содержанием полимера проблематично. Факторы, обеспечивающие суперпродукцию ПГА, видо- и штаммоспецифичны, поэтому основополагающей задачей для биотехнологии этих биомолекул является исследование и нахождение условий, максимизирующих выходы ПГА у конкретных штаммов.

Характеристики автотрофной культуры бактерий C. eutrophus В- в режиме аккумуляции ПГА в хемостате.

Ограничение роста бактерий, вызванное дефицитом минеральных элементов, изменяло соотношение внутриклеточных макромолекул в сторону аккумуляции резервных соединений, ПГА представленных гомополимером 3-гидроксимасляной кислоты - поли-3-гидроксибутиратом (П3ГБ). Содержание полимера составило максимально (около 40 %) при азотном лимите; до 20-25 % при лимитировании роста бактерий по сере и фосфору; наименьшее содержание полимера наблюдалось при лимитировании калием и магнием. Наиболее высокие значения внутриклеточной концентрации ПГА на моноуглеродном субстрате (СО2), были получены при снижение удельной скорости роста бактерий () до 0,1 ч-1.

Положительным моментом хемостатного режима является возможность получения целевого продукта неограниченно во времени, негативным – весьма низкое содержание биомассы в культуре (не более 5 %) и полимера в клетках (около 40 %). При этом возникает необходимость введения в технологическую цепочку непрерывно работающего энергоемкого блока разделения низкоплотной (не выше 0,05 %) культуральной среды. Дальнейшее углубление лимита по элементам и вытекающее из этого снижение скорости протока среды повышает вероятность контаминации.

Характеристики роста и синтеза ПГА бактериями C. eutrophus В-10646 при гетеротрофных условиях питания. Продукционные характеристики автотрофной культуры C. eutrophus В-10646 сопоставимы с характеристиками культуры R.eutropha В-5786, поэтому изучение различных режимов выращивания проводилось на бактериях C. eutrophus В-10646. Отличие режимов заключалось в варьировании входного потока лимитирующего элемента (азот) и длительности процесса (рисунок 1).

Первый режим при отсутствии лимитирования по азоту, обеспечил накопление биомассы до 30 г/л за 70 ч, содержание П3ГБ составило 55 % (рисунок 1а).

Второй режим осуществлялся в два этапа; первый - 35 ч на полной питательной среде с непрерывной подачей азота в культуру (120 мг/г биомассы); второй - в безазотной среде. В конце первого этапа содержание полимера в клетках не превышало %. Второй этап – 45 ч обеспечил увеличение внутриклеточного содержания П3ГБ в результатов предложен и исследован новый автотрофный двустадийный хемостатно-периодический процесс культивирования бактерий C. eutrophus для получения ПГА. На первом этапе осуществляли проточный хемостатный режим с подачей полной солевой среды и азота на в) I – 50 % лимит по азоту; II – без азота Х – концентраци биомассы, г/л; кращали и переходили на лимитированП3ГБ – удельная скорость синтеза П3ГБ, % Рисунок 1 – Исследованные режимы выращива- Спустя 25 ч подачу азота в культуру останавливали.

ния C. eutrophus в режиме синтеза П3ГБ Далее процесс проводили на среде без подачи азота в течение 35-40 ч. К концу опыта содержание полимера в клетках составило (70±5) %, концентрация биомассы (45±2) г/л.

Предложенный режим сократил стадию получения инокулята и первый этап периодического процесса и позволил в течение 70 ч получить высокие выходы продукта при общей концентрации биомассы до (45±2) г/л. Продуктивность процесса составила: по биомассе 0,7 г/лч, по полимеру 0,55 г/лч.

2 Характеристики роста и синтеза ПГА бактериями C. eutrophus В- при гетеротрофных условиях питания Ранее процесс культивирования на глюкозе не был реализован, так как штамм R.eutropha B5786 из сахаров утилизировал только фруктозу, а R.eutropha B8562 имел небольшой интервал границ физиологической устойчивости (концентрация глюкозы – 10 г/л), что приводило к неустойчивому росту. Бактерии исследуемого штамма C.

eutrophus В-10646 способны к росту на сахарах (фруктоза, глюкоза), органических кислотах, аминокислотах спиртах и др.

Установлено, что концентрация глюкозы для данного штамма в периодической культуре не должна быть ниже 5 и выше 35 г/л, последнее значительно выше, чем у ранее полученного штамма R.eutropha B8562 (15 г/л).

Влияние физиологической активности посевного материала на длительность лаг-фазы, удельную скорость бактерий, выходы ПГА и урожай биомассы. Результаты исследования влияния внутриклеточного пула ПГА на длительность Рисунок 2 - Влияние исходной концентрации П3ГБ в посевном материале C. eutrophus на длительность лагПри содержании полимера фазы и динамику накопления биомассы (кривые 1,2,3 и длительность лаг-фазы составила, соответственно 6 и 8 ч, что негативно сказывалось на продукционных показателях культуры. В первые часы отмечено снижение внутриклеточной концентрации полимера в результате его эндогенной утилизации, и только после снижения концентрации полимера в клетках до 10 % начинался рост клеток. В целом за процесс ферментации (60 ч) концентрация биомассы в зависимости от содержания П3ГБ в инокуляте составила от 45 до 65 г/л.

риале на кинетические и продукционные характеристики культуры C. eutrophus. Применение более концентрированного инокулята, наращивание которого в условиях продуктивности процесса инокулят выращивали до получения концентрации клеток не выше (1,0±0,2) г/л и содержанием полимера в них (8±2) %. Далее в стерильных концентрации клеток в инокуляте на конечную концентрацию биомассы. Использование более концентрированного посевного материала позволило увеличить коч 1 - 15 г/л; 2 - 8,3 г/л; 3 - 4,8 г/л нечную концентрацию биомассы до 120 г/л.

Рисунок 3 - Влияние концентраПродуктивность процесса при стартовой конценции клеток в инокуляте на динатрации инокулята 4,8; 8,3 и 15,0 г/л составила: по биомику накопления биомассы соответственно. Затраты глюкозы – (2,7±0,1) г/г биомассы и (2,9±0,1) г/г полимера.

Таким образом, исследованы процессы синтеза ПГА в различных условиях питания в культуре C. eutrophus В-10646 и показано, что автотрофный процесс позволяет получать концентрацию биомассы (45±2) г/л с содержанием полимера до (75±5) %. В гетеротрофном процессе на глюкозе возможно получение до 120 г/л биомассы с содержание полимера 90 % и выше.

3 Технология культивирования водородных бактерий для получения ПГА различного химического строения Специфичность биосинтеза сополимерных ПГА, связанная с необходимостью внесения в культуру дополнительных С-субстратов, токсичных для бактерий, негативно сказывается на урожае биомассы и общем выходе полимера, потери которых, в зависимости от типа синтезируемого второго мономера и величины его включения в сополимер, могут достигать 30 %.

Разработан процесс для получения сополимерных ПГА за счёт изменения источника углеродного питания. При введении в культуру бактерий добавок солей алкановых кислот, которые являются предшественниками для образования мономеров различного строения С-цепи, синтезирована линейка ПГА различного химического строения. Величина и режим дозированного введения в культуру второго углеродного субстрата реализованы с учётом их предельно допустимых концентраций для бактерий С-субстратов.

Культивирование C. eutrophus В10646 на смешанном углеродном субстрате (глюкоза+валерат калия), который вносили в конце первого этапа (25-30 ч), обеспечил получение сополимеров 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ) [ C (C2H5) C 2 C ]n. Синтез сополимеров 3-гидроксибутирата/3гидроксигексаноата (П3ГБ/3ГГ) [ O C (C3H7) C 2 C ]n вследствие более высокой токсичности для бактерий гексаноата – трудно реализуемая задача. В автотрофной культуре при добавлении гексаноата в среду получены образцы П3ГБ/ГГ с включением 3ГГ до 5-10 мол.%. Гетеротрофный режим на глюкозе с добавлением в культуру, помимо гексаноата калия, акрилата – ингибитора кетотиолазы, фермента, расщепляющего С-цепи мономеров, в частности гексаноата, позволил получить более широкую линейку сополимеров П3ГБ/3ГГ. Четвертым синтезированным типом ПГА стали сополимеры 3-гидрокисмасляной и 4-гидроксимасляной кислот (П3ГБ/4ГБ) С использованием разработанных режимов культивирования штамма C. eutrophus В10646, в условиях автотрофного и гетеротрофного роста на средах, содержащих в качестве источника углерод различные субстраты (CO2, глюкоза, масляная кислота и -бутиролактон), синтезированы образцы сополимеров 3ГБ/4ГБ с включением мономеров 4ГБ от 6 до 28 мол %. Результаты сравнительного исследования физикохимических свойств ПГА различного химического состава показаны на рисунок 4.

Рисунок 4 - Зависимость температуры плавления (а) и степени кристалличности (б) сополимерных ПГА от типа и величины фракции второго мономера Включение в цепь П3ГБ звеньев 4ГБ, 3ГВ или 3ГГ снижает температуры плавления и термической деградации, относительно этих величин у гомогенного П3ГБ, с сохранением термостабильности. Степень кристалличности сополимерных ПГА в целом ниже, чем у П3ГБ (75±5) %. Выраженность влияния на соотношение аморфной и кристаллических фаз у сополимерных образцов усиливается в ряду:

3-гидроксивалерат3-гидроксигексаноат4-гидроксибутират.

Самые низкие значения степени кристалличности (ниже 20 %) зарегистрированы у сополимеров 3-гидроксибутирата с 4-гидроксибутиратом.

Таким образом, используя разработанный двустадийный периодический режим культивирования бактерий, без существенной перестройки технологического процесса в целом, варьируя условия углеродного питания C. eutrophus В10646, реализованы способы получения образцов ПГА с различным соотношением мономеров, существенно различающиеся физико-химическими свойствами.

4 Сравнительное исследование методов экстракции ПГА из биомассы клеток с применением различных методов и экстрагентов Вторым по значимости и затратности элементом технологии производства ПГА является способ выделения полимера из биомассы клеток. Известные методы экстракции ПГА не отвечают всем необходимым требованиям (экологичность, невысокие затраты на реагенты, полнота извлечения и чистота полимера), это актуализирует совершенствование методов экстракции как необходимое условие повышения эффективности процесса в целом и снижения стоимости полимера как конечного продукта биотехнологии.

Экстракция ПГА органическими растворителями. Исследовано влияние на выход и чистоту ПГА таких факторов как: соотношение биомасса : растворитель, температура, кратность экстракции.

Экстракция ПГА из биомассы клеток растворителями, при варьировании состава экстрагентов, позволяет достичь полноты извлечения полимера (87±5) % и минимизировать примеси (таблица 1).

Добавление к хлороформу или дихлорметану этилового спирта и проведение трёхкратной экстракции с нагреванием повышает выход П3ГБ до 92 %, однако при последующем добавлении гексана для осаждения полимера, образуется азеотропная смесь гексан - этанол. Полученные образцы содержали остаточные липиды и жирные однако имело значительное падеРисунок 5 – Молекулярно-массовое распределение ние молекулярной массы полимеП3ГБ выделенного модифицированным методом ра от 6,2105 до 3,4105 г/моль (рисунок 5).

Для получения высокоочищенного полимера необходима вторая стадия очистки, которая заключается в повторном растворении и осаждении, что приводи к двойному расходу растворителей. Образование азеотропных смесей делает невозможным возврат растворителей в процесс и сопряжено с образованием больших объёмов органических отходов.

Таблица 1 – Результаты экстракции П3ГБ органическими растворителями различными способами * - азеотропная смесь хлороформ гексан (72:28);

** - азеотропная смесь этиловый спирт-дихлорметан (3,5:96,5);

*** - азеотропная смесь гексан-этанол (79:21);

**** - азеотропная смесь ацетон-вода (88:12) «Безреагентный» метод экстракции. Исследован метод выделения полимера с применением поверхностно-активных веществ, обработкой клеточной массы различными концентрациями додецилсульфата натрия (ДДС-Na) при различных температурах и времени обработки (таблица 2).

Таблица 2 - Выход полимера П3ГБ после обработки биомассы ДДС-Na Данный метод позволил получить образцы полимера с низким остаточным содержанием липидов (0,4 – 0,6 %), однако в полимере помимо липидов и жирных кислот, зафиксировано наличие белковых веществ в концентрации до 6 %.

С целью повышения полноты извлечения полимера и снижения количества примесей в нем исследован комбинированный метод, при котором биомассу предварительно обрабатывали раствором 5 %-го ДДС-Na в течение часа при 60 0С, затем центрифугировали и отмывали водой. Далее проводили очистку дихлорметаном с последующим осаждением П3ГБ гексаном. Для этого полимер, полученный на первой стадии, трёхкратно экстрагировали равными порциями дихлорметана в соотношении 1:10 при нагревании.

В полученных образцах примеси отсутствовали. Степень извлечения П3ГБ составила 98 – 99 %. Молекулярная масса составила от 6,2105 - 6,8105 г/моль, коэффициент полидисперсности для образцов лежал в пределах 2,9 – 3,2.

Учитывая сложность процесса экстракции ПГА из биомассы бактерий, выполнена оптимизация технологии, основанная на регрессионном анализе многофакторного эксперимента. Найдены оптимальные параметры процесса: концентрация ДДС-Na 5 %; температура 60 0С, время обработки 40 мин.

5 Технология синтеза ПГА и её технико-экономическое обоснование Технология опытного производства ПГА. Получены исходные данные для проектирования опытного производства, основанные на экспериментально достигнутых показателях синтеза ПГА культурой C. eutrophus В-10646 на глюкозе, которые включают: хемостатно-периодический, двустадийный процесс (лимит азота/среды без азота); стартовая концентрация инокулята (10±2) г/л; время культивирования 65 ч; выход биомассы (110±10) г/л; содержание ПГА (85±5) %; расход глюкозы (2,9±0,1) кг/кг ПГА; расход воздуха 20 м3/кг ПГА; способ экстракции комбинированный, продуктивности процесса по биомассе и ПГА, соответственно, 1,7 и 1,4 г/лч; расход ДДС-Na 0,61 кг/кг ПГА; расход органических растворителей 4,4 кг/кг ПГА.

На основании анализа полученных результатов и выполненного техникоэкономического анализа лабораторных процессов синтеза ПГА для масштабирования выбран вариант процесса, реализуемый на глюкозе. Разработана технологическая схема процесса (рисунок 6).

На предферментационной стадии осуществляется подготовка и стерилизация оборудования водяным паром в течение 60 мин при давлении 0,12 МПа. Для получения пара используется электрический парогенератор (2), производительностью 50 кг/ч.

Стеклянные колбы, а также маточные растворы стерилизуются в автоклаве (3). Для приготовления среды используют пять растворов А, Б, В, Г, Д (Раствор А – К3РО4, Na3РО4, MgSO4; Раствор Б - C6H5O7FenH2O; H3BO3; Раствор В - CuSO4; ZnSO4; NiCl2;

CoCl2; MnCl2; NaMoO4; Раствор Г - (NH2)2CO; Раствор Д - C6 H12O6 или синтез-газ) После стерилизации в колбах (ёмкость 2 л) готовят среду и вносят культуру C. eutrophus В10646. После чего колбы устанавливают в шейкер-инкубатор (4) и инкубируют в течение 20 – 22 ч при 30 0С. Затем полученный инокулят переносят в ферментёр-инокулятор (5), в котором уже находится приготовленная среда в количестве 10 л.

Процесс выращивания биомассы в ферментёре-инокуляторе длится 4 – 6 ч в режиме хемостата. Это позволяет получить необходимое для засева производственного аппарата количество инокулята, который концентрируют на центрифуге (8). Полученный инокулят в количестве 100 л по стерильной посевной линии поступает в производственный ферментёр (10). Культивирование происходит в две стадии. На первой стадии происходит накопление биомассы в течение 24 ч до концентрации 40 – 50 г/л. На данном этапе используются подпитывающие растворы карбамида и глюкозы. На второй стадии лимитируют подачу азота (подпитывающий раствор карбамида). В этот момент концентрация биомассы перестаёт увеличиваться, а содержание полимера в клетках растёт. Длительность стадии составляет 30 ч.

После процесса ферментации полученная культуральная жидкость сливается в сборник (11), откуда далее поступает в вакуум-выпарную установку (12), где концентрируется до 300 – 350 г/л, а затем перистальтическим насосом (6) подается в сборник упаренной суспензии (18). Упареную суспензию подвергают дальнейшему концентрированию в центрифуге (17). Полученная паста с влажностью 50 % подаётся в экстрактор (15); туда же из сборника чистого растворителя (13) подаётся 5 %-й раствор додецилсульфата натрия в количестве 4 – 5 л/кг пасты. Процесс экстракции ведут при температуре 60 0С в течение часа, с постоянным перемешиванием.

Затем полимер отделяют от экстракта в центрифуге (17), полученный фугат направляют на очистку, а полимер подаётся в сборник (16), оснащенный мешалкой, где промывается дистиллированной водой. От промывной жидкости готовый полимер отделяется в центрифуге (17), затем сушится и стерильно упаковывается. Для получения высокоочищенного полимера, производят его доочистку при растворении в дихлорметане с последующим осаждением гексаном.

Оборудование: 1 – компрессор; 2 – парогенератор; 3 – автоклав вертикальный 4 – шейкер-инкубатор; 5 – ферментёр-иннокулятор; 6 – насос перистальтический; 7, 9, 11, 13, 14 – ёмкости; 8, 17 – центрифуга;10 – производственный ферментёр; 12 – вакуум-выпарная установка; 15 – экстрактор с мешалкой; 16 – ёмкость с мешалкой; 20 – аквадистиллятор электрический.

Раствор А – К3РО4, Na3РО4, MgSO4; Раствор Б - C6H5O7FenH2O; H3BO3; Раствор В - CuSO4; ZnSO4; NiCl2; CoCl2; MnCl2; NaMoO4; Раствор Г - (NH2)2CO Технико-экономическое обоснование. Реализация устойчивых и регламентированных процессов синтеза ПГА бактериями C. eutrophus В10646 в масштабированном варианте (в биореакторах объемом от 12 до 60 л) позволило определить материальные затраты и выполнить предварительную технико-экономическую оценку способов получения полимеров при использовании различных субстратов.

Расчеты выполнены с учетом достигнутых продукционных показателей при различных субстратных сценариях, прогнозируемый объем производства 100 000 т/г (таблица 3).

Таблица 3 - Технико-экономические показатели производства ПГА составить в зависимости от типа субстрата от 229 до 290 руб./кг ПГА. Вариант производства на газовом субстрате при использовании модельных газов приводит к высокой себестоимости продукта и оказывается не рентабельным. Наиболее перспективным субстратом из сахаров является глюкоза, фруктоза имеет более высокую стоимость.

ВЫВОДЫ

1. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры Сupriavidus eutrophus В10646 и при автотрофных и гетеротрофных условиях питания в режиме синтеза резервных полигидроксиалканоатов; показано, что максимальные выходы полимеров на газовом субстрате (смеси Н2, СО2 и О2) составляют (75 5) % при экономических коэффициентах по H2, O2, CO2= 1,1; 0,25; 0,36; на глюкозе – (90 5) % при экономическом коэффициенте 0,3.

2. На основе сравнительного исследования проточного и периодического способов выращивания С.eutrophus в автотрофной культуре в ферментере с коэффициентом массопереноса по кислороду 460 ч-1, различающихся режимом подачи в культуру потока лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего аккумуляцию полигидроксиалканоатов, предложен хемостатно-периодический процесс, обеспечивающий продуктивность процесса по биомассе и полимеру до 0,71 и 0,57 г/лч при длительности ферментационного цикла не более 70 ч.

3. Реализован и исследован периодический процесс синтеза полигидроксиалканоатов культурой С.eutrophus на глюкозе при изменении внутриклеточного пула полимера, физиологической активности и плотности инокулята. Установлено, что при текущей концентрации глюкозы от 5 до 35 г/л и исходном содержании полимера в инокуляте не выше 10 %, концентрация биомассы и содержание полимера достигают (110 10) г/л и (90 5) % при продуктивности процесса 1,7 и 1,45 г/л ч, соответственно, что в 2 раза выше ранее достигнутых показателей R. eutophus B5786 на фруктозе.

4. Разработаны режимы синтеза полигидроксиалканоатов различного химического состава, включающие дозированную подачу в культуру второго углеродного субстрата – солей алкановых кислот (валерата, гексаноата) и -бутиролактона, в пределах установленных допустимых концентраций. Синтезированы образцы, различающиеся степенью кристалличности (от 12 до 76 %) и термостабильностью.

5. На основании проведённых исследований процессов экстракции полигидроксиалканоатов из биомассы клеток разработан метод, обеспечивающие выход высокоочищенного полимера более 96 % без существенного изменения молекулярномассовых характеристик.

6. Выполнено технико-экономическое обоснование производства при различных субстратных сценариях. Показано, что в зависимости от типа ростового субстрата (электролизный водород+СО2+О2), синтез-газ+О2, глюкоза или фруктоза затраты на получение полимера варьируют от 230 до 730 руб./кг.

7. На основании экспериментальных данных и их анализа разработана технология эффективного синтеза ПГА на глюкозе с использованием водородных бактерий C. eutrophus. Технология реализована в проекте опытного производства «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов». Проект прошел государственную экспертизу (положительное заключение экспертизы № 24-1-50196-12).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Fundamental basis of production and application of biodegradable polyhydroxyalkanoates / T.G. Volova, E.I. Shishatskaya, N.O. Zhila, E.G. Kiselev, P.V. Mironov, A.D. Vasiliev, I.V. Peterson, A.J. Sinskey // Journal Siberian Federal university. ser. Biol. – 2012. – Т.5. – № 3. – С. 280-299, автора – 0,15 п.л.

2. Киселев, Е.Г. Технико-технологические основы производства разрушаемых полигидроксиалканоатов / Е.Г. Киселев, О.Н. Шишацкий, Э.Дж. Сински // Журнал Сибирского федерального университета. сер. Биол. -2012.-Т.5. - № 3. – С.300-310, автора – 0,21 п.л.

3. Киселев, Е.Г. Оптимизация процесса экстракции ПГА из биомассы / Е.Г. Киселев // Биотехнология новых материалов и окружающая среды: материалы II-го науч.

семинара. – Красноярск: СФУ, 2012. – С. 21-23, автора – 0,19 п.л.

4. Физико-химические свойства полигидроксиалканоатов различного химического строения / Н.О. Жила, Е.И. Шишацкая, Е.Г. Киселев, А.Д. Васильев, П.В. Миронов, A.J. Sinskey // Биотехнология новых материалов и окружающая среды: материалы II-го науч. семинара. – Красноярск: СФУ, 2012. – С. 24-25, автора – 0,02.

5. Киселев, Е.Г Разработка процессов экстракции поли-3-гидроксибутирата из биомассы Ralstonia Eutropha / Е.Г Киселев // Лесной и химический комплексыпроблемы и решения: материалы всерос. науч.-практ. конф. – Красноярск: СибГТУ, 2012. – С. 153-155, автора – 0,19 п.л.

660036 Красноярск, Академгород, 50/28, оф.