На правах рукописи

Коннова Татьяна Анатольевна

ВЛИЯНИЕ МИНОРНЫХ МОДИФИКАЦИЙ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ШАПЕРОНОПОДОБНУЮ

АКТИВНОСТЬ БЕТА-КАЗЕИНА

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань – 2012

Работа выполнена в лаборатории биофизической химии наносистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук (КИББ КазНЦ РАН) и лаборатории функциональных взаимодействий белков Национального института агрономических исследований (НИАИ), Нант, Франция.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор заведующий лабораторией КИББ КазНЦ РАН, г. Казань Юрий Федорович Зуев профессор, заведующий лабораторией НИАИ, г. Нант, Франция Тома Эртле

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва Владимир Израилевич Муронец доктор химических наук, профессор КФУ, г. Казань Валерий Виленович Горбачук

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.

Баха Российской академии наук, г. Москва

Защита состоится 24 декабря 2012 г. в 1100 часов на заседании диссертационного совета Д002.005.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при КИББ КазНЦ РАН по адресу:

420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я №30, тел/факс (843)2927347.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке КазНЦ РАН.

Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Анастасия Анатольевна Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Постановка проблемы и ее актуальность. Молекула бета-казеина – одного из основных молочных белков – в отличие от типичных глобулярных белков обладает слабо выраженными элементами вторичной структуры [Creamer et al., 1981; Caessens et al., 1999]. Все полярные и заряженные остатки сконцентрированы на N-конце полипептидной цепи, в то время как остальная ее часть состоит преимущественно из остатков неполярных аминокислот и содержит большое количество пролиновых остатков [Swaisgood, 1992, 1993, 2003]. В первичной последовательности бетаказеина отсутствует цистеин, что исключает возможность образования внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей. Сочетание амфифильного строения и высокой гибкости полипептидной цепи бета-казеина приводит к ассоциации белка в водной среде с образованием наноразмерных коллоидных агрегатов – мицелл [Schmidt, Payens, 1972; Niki et al., 1977; Evans et al., 1979; Swaisgood, 2003].

Бета-казеин является удобной моделью для изучения различных аспектов строения коллоидной системы молока и связанных с ней функций. Строение поверхности коллоидных агрегатов молочных казеинов, где гидрофильные участки перемежаются с гидрофобными, их высокая связывающая способность по отношению к гидрофобным соединениям и возможность адаптации геометрии поверхности под связываемый лиганд определяют ряд функциональных особенностей молока. Кроме того, эти свойства в последние годы вызвали интерес к шапероноподобной функции казеинов [Bhattacharyya, 1999; Morgan et al., 2005; Barzegar et al., 2008; Hassanisadi et al., 2008; Yousefi et al., 2009]. Коллоидные свойства и шапероноподобная активность бета-казеинов имеют прикладное значение, благодаря способности стабилизировать микроэмульсии и эмульсии в пищевой промышленности, что определяет текстуру и вкусовые качества пищевых продуктов.

Одним из возможных подходов получения бета-казеина с новыми физикохимическими и функциональными свойствами является изменение его структуры методами белковой инженерии. Процесс самоорганизации бета-казеина чрезвычайно чувствителен к физико-химическим свойствам среды (полярности и вязкости растворителя, температуре, рН и т.п.), что влияет на размер, структуру и сорбционные свойства его коллоидных агрегатов [Schmidt, 1982; Leclerc, Calmettes, 1997; De Kruif, Grinberg, 2002; Mikheeva et al., 2003; O'Connell et al., 2003]. Кроме того, было показано, что точечное введение цистеиновых остатков в полипептидную цепь этого белка приводит к образованию димерных или олигомерных комплексов и значительно изменяет свойства мицеллярных агрегатов (размер, форму, температуру перехода мономер-мицелла, устойчивость к изменению рН и пр.) [Gaudin et al., 2009;

Yousefi et al., 2009]. При этом, вероятно, могут происходить изменения функциональных свойств бета-казеина, в частности, его шапероноподобной активности. К настоящему времени работ по исследованию взаимосвязи структуры и функциональных особенностей бета-казеина немного и нет ясности, в какой степени структура белка определяет эти свойства.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление вклада структурных особенностей бета-казеина в его ассоциативные, коллоидные и шапероноподобные свойства.

';

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить очищенные препараты рекомбинантного бета-казеина дикого типа и его модифицированных форм, содержащих цистеиновые остатки в различных участках полипептидной цепи белка.

2. Охарактеризовать структуру и процессы самоассоциации рекомбинантных бета-казеинов методами динамического светорассеяния, флуоресценции, кругового дихроизма (КД) и инфракрасной спектроскопии (ИК).

3. Проанализировать влияние температуры и состава растворителя на структуру и свойства бета-казеина.

4. Охарактеризовать шапероноподобную активность природной и рекомбинантных форм бета-казеина по отношению к термо-индуцированной агрегации ряда целевых белков.

взаимодополняющих физических методов исследована взаимосвязь структурного состояния рекомбинантных бета-казеинов с цистеиновыми остатками, введенными в различные участки полипептидной цепи белка, с их ассоциативными и шапероноподобными свойствами.

Впервые выполнен всесторонний анализ структурных данных и самоассоциации бета-казеина в смешанном растворителе вода-этанол. Показана корреляция между микрофазным разделением водно-спиртовых растворов, вторичной структурой белка и строением мицелл бета-казеина.

Впервые установлено наличие верхней и нижней границ температурного интервала самоассоциации бета-казеина; при этом увеличение концентрации спирта вызывает понижение как верхней, так и нижней температур мицеллообразования.

Впервые аргументировано, что высокая стабильность вторичной структуры бета-казеина в условиях повышения температуры является кажущейся и обусловлена ограничениями методов разложения спектров КД в приложении к нативнонеупорядоченным белкам.

Впервые исследована шапероноподобная активность бета-казеина в отношении каталитического действия фермента в условиях действия повышенной температуры.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты уточняют границы коллоидного состояния бета-казеина и дополняют имеющиеся данные о механизмах мицеллообразования белка. Понимание механизмов самоассоциации и взаимодействия бета-казеина с целевыми белками на молекулярном уровне, открывает перспективы для создания белковых препаратов медицинского назначения, исследования и лечения ряда заболеваний, известных как «конформационные».

Результаты работы могут быть использованы для прогнозирования влияния температуры и состава растворителя на структуру и функции бета-казеина и других нативно неупорядоченных белков, а также для направленного получения белков с новыми физико-химическими свойствами для пищевой промышленности и биотехнологии.

Полученные экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях биологического, медицинского, биотехнологического, физико-химического профилей, занимающихся исследованием взаимосвязи структуры и функций биомакромолекул, динамики белков в водноорганических средах, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, биофизике, физической и органической химии, и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования проводились в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Межмолекулярные взаимодействия и молекулярная динамика как факторы регуляции функциональной активности белков»

(номер госрегистрации №0120.0 803026) и поддержаны грантом правительства Франции для обучения в совместной аспирантуре, грантами РФФИ, а также грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»). Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 12-ой Международной школе-конференции молодых ученых: «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), IV Российском симпозиуме “Белки и пептиды” (Казань, Россия, 2009), 34-ом конгрессе FEBS «Life’s Molecular Interaction» (Прага, Чехия, 2009), Российской школе-конференции молодых ученых “Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, Россия, 2010), V Российском симпозиуме “Белки и пептиды” (Петрозаводск, Россия, 2011), 3-м Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений»

(Казань, Россия, 2011), I Российском симпозиуме по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, Россия, 2011), 36-ом конгрессе FEBS «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Турин, Италия, 2011), VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, Россия, 2011), Конференции молодых ученых в области науки о жизни (Париж, Франция, 2012); на семинарах лаборатории функциональных взаимодействий белков НИАИ (Нант, Франция, 2008 – 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 17 работ;

из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. В работе представлено 49 рисунков и таблицы. Список литературы включает 290 источников, из них 271 зарубежных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили нативный бета-казеин коровьего молока (Lactalis, France), рекомбинантные формы бета-казеина дикого типа и содержащие аминокислотные замены/вставки цистеинового остатка в различных участках полипептидной цепи.

Приготовление образцов. Белки растворяли в Na-фосфатном буфере мМ, pH 7.4. Стоковые растворы разбавляли буфером и этанолом до получения нужной концентрации белка и спирта.

Получение рекомбинантных форм бета-казеина. Наработку рекомбинантных форм бета-казеина проводили в бактериальных системах экспрессии. Для этого в штаммы-продуценты E.coli Rosetta (DE3) pLysS и BL21 (DE3) встраивали плазмиды на основе векторов pET21-d (+) и pET32-b, содержащих первичные последовательности бета-казеинов дикого типа и модифицированных (Novagen, США). Модификацию первичной последовательности бета-казеина С проводили с помощью метода сайт-направленного мутагенеза (QuikChange, Invitrogen, США). Культуры клеток E.coli выращивали в питательных средах LB (Luria-Bertani) [Гловер, 1988] с добавлением соответствующего антибиотика (хлорамфеникола, ампициллина). Индукцию экспрессии рекомбинантных белков бактериальными продуцентами проводили добавлением ИПТГ (изопропил--Dтиогалактозид). После получения клеточных лизатов проводили трехстадийную (анионообменную и две обратно-фазовые) хроматографическую очистку белков методом FPLC с использованием системы kta Purifier, оснащенной программным обеспечением Unicorn Control (Amersham Biosciences, США).

Самоассоциация бета-казеина. Гидродинамические диаметры бетаказеина в молекулярном и мицеллярном состояниях определяли методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания). Для расчета радиуса частиц по автокорреляционным кривым использовали метод CONTIN.

Спектры флуоресцентного излучения триптофана записывали в диапазоне длин волн 300 - 400 нм при длине волны возбуждения 295 нм на спектрофлуориметре Hitachi F-4500 (Hitachi, Япония). Спектры корректировали вычитанием спектра рамановского поглощения воды. Значения максимума флуоресценции определяли с использованием программы Peak Fit (Systat Software, Великобритания).

Вторичная структура бета-казеина. Спектры КД были записаны на спектрополяриметре Jas.co J-810 (Jas.co Incorporated, США) в дальней УФ области в кюветах Hellma 106-QS с длиной оптического пути 0.02 см. Анализ вторичной структуры белков по спектрам КД был выполнен с использованием алгоритма расчета [Provencher, Glockner, 1981] и программы CONTINLL [Whitmore, Wallace, 2008] с сайта DICHROWEB (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk), базисный набор белков № [Janes, 2005; Wallace, Janes, 2009].

Спектры ИК регистрировали на спектрофотометре Tensor 27 (Bruker, Германия), спектральное разрешение 4 см-1, 128 сканов. Для приготовления образцов использовали дейтерированную воду (D2O, Aldrich 151882-100G, 99.9%).

Исследуемые растворы помещали в термостатируемую кювету из CaF2 c толщиной слоя 100 или 10 мкм. Из спектров растворов бета-казеина вычитали спектры соответствующих растворителей, снятые при тех же температурах, и спектры паров атмосферной воды. Сглаживания спектров не производили.

Определение шапероноподобной активности рекомбинантных бетаказеинов.

1.5.1. Антиагрегационные свойства бета-казеина.

Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы и каталазы. Для оценки антиагрегационных свойств бета-казеина использовали тест-систему, основанную на подавлении агрегации модельных белковых субстратов – алкогольдегидрогеназы (АДГ) из лошадиной печени (Sigma Aldrich) и каталазы из коровьей печени (Sigma Aldrich) [Bhattacharyya, Das, 1999]. Кинетику агрегации прослеживали по изменению коэффициента поглощения раствора при 360 нм на спектрофотометре Lambda (Perkin Elmer, США). Агрегацию АДГ индуцировали нагреванием реакционной смеси до температуры 48°С, каталазы – до 55°С. Для описания кинетических кривых агрегации использовали уравнение:

A Alim{1 exp[ k1 t t0 ]} (t t0 ) [Курганов, 2002]. Для количественного описания шапероноподобной активности (АШ) бета-казеинов использовали формулу:

АШ [1 (k1 Alim ) /( k1 Alim )] 100%.

Тепловая денатурация моноклональных иммуноглобулинов G (IgG).

Антиагрегационные свойства бета-казеина оценивали по изменению иммунореактивности моноклональных к бета-лактоглобулину при температурном воздействии. Активные концентрации антител определяли методом непрямого ИФА, общая концентрация белка была измерена методом Bradford [1976].

1.5.2. Ферментативная активность АДГ. Активность АДГ определяли по изменению оптического поглощения реакционной среды при 340 нм. Реакцию инициировали внесением фермента, предварительно проинкубированного при заданной температуре, в реакционную смесь. Активность фермента контролировали по начальной скорости реакции окисления этанола. Все спектрофотометрические измерения осуществляли на приборе Lambda 25 (Perkin Elmer, США).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рекомбинантного бета-казеина. В работе были использованы нативный бета-казеин, рекомбинантный бета-казеин дикого типа и рекомбинантные мутантные формы, содержащие цистеин в начале цепи, в 30-м и положениях, а также двойной мутант С0-208:

Плазмиды, содержащие первичные последовательности бета-казеинов дикого типа b-CN WT и несущих мутации b-CN C0, b-CN С208, b-CN C0-208 были предоставлены лабораторией функциональных исследований белков Национального института агрономических исследований (Нант, Франция). Модификация бетаказеина заменой изолейцина в 30 положении на цистеин (b-CN C30) была произведена нами в КИББ КазНЦ РАН.

Структурные и физико-химические свойства бета-казеина.

2.2.1. Олигомеризация цистеинсодержащих бета-казеинов. Введение цистеиновых остатков в структуру бета-казеина способствует образованию внутри и межмолекулярных дисульфидных связей. Введение цистеина в концевые или центральный участки полипептидной цепи вызывало спонтанную димеризацию бетаказеина (рис. 1А), а двойная замена в концевых участках приводила к образованию олигомеров и «кольцевой» формы белка (рис. 1Б). Присутствие в растворе некоторого количества олигомеров наблюдали сразу же после растворения рекомбинантных белков. К 24 часам после начала эксперимента практически все мономеры белка переходили в олигомерную форму.

2.2.2. Влияние внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей на процесс самоассоциации бета-казеина. Для исследования процесса самоассоциации бета-казеина использовали метод динамического светорассеяния. При нагреве растворов нативного и дикого типа бета-казеинов происходил переход из молекулярного состояния со средним гидродинамическим диаметром частиц 7-8 нм в мицеллярное (17-18 нм). Положение мицеллярного перехода на температурной шкале зависело от концентрации бета-казеина (рис. 2А). Способность бета-казеина к мицеллообразованию сохранялась и для модифицированных форм. Для димеров bCNC0, bCN-С30 и bCN-С208 отмечено снижение температуры мицеллярного перехода по сравнению с безцистеиновыми формами (рис. 2Б). Олигомеры bCN-C0- находились в растворе в форме мицеллярных ассоциатов с гидродинамическим диаметром 18-23 нм во всем исследованном температурном интервале. В присутствии редуцирующего агента (меркаптоэтанола) профили изменения размеров частиц цистеинсодержащих белков аналогичны профилям бета-казеина нативного и дикого типа. При этом мицеллярные ассоциаты восстановленных форм бета-казеинов, Dгидр, нм Dгидр, нм содержащих цистеин в начале полипептидной цепи, оказывались неустойчивыми к действию повышенных температур (рис. 2В). Таким образом, образование меж- и внутримолекулярных дисульфидных связей, облегчая взаимодействие гидрофобных участков полипептидной цепи, способствует ассоциации бета-казеина.

Аналогичная данным светорассеяния картина для самоассоциации различных форм бета-казеина наблюдалась методом триптофановой флуоресценции.

Единственный триптофановый остаток, локализованный в гидрофобной части молекулы бета-казеина, при самоассоциации белка, погружаясь вглубь мицелл, оказывался в менее полярном окружении, что проявлялось в «голубом» сдвиге максимума флуоресценции. При низких температурах значения MAX для всех рекомбинантных бета-казеинов в мономерной форме заметно ниже, чем для нативного бета-казеина (рис. 3А), что может свидетельствовать о более компактной организации их молекул. Наличие или отсутствие мицеллярного перехода для олигомерных форм С0, С30 и С208 (рис. 3Б) согласуется с данными светорассеяния.

Таким образом, наличие димеров, олигомеров и формы "intra", т.е. формирование внутри- и межмолекулярных связей, оказывает значительное влияние на поведение бета-казеина в процессе самоассоциации.

MAX, нм Рис. 3. Температурная зависимость положения максимума триптофановой флуоресценции рекомбинантного бета-казеина (концентрация 0.4 мг/мл). А - мономерные формы, Б олигомерные формы.

2.2.3. Вторичная структура цистеинсодержащих бета-казеинов. Для изучения вторичной структуры рекомбинантных бета-казеинов использовали метод спектроскопии кругового дихроизма. Олигомеры и мономеры рекомбинантных бетаказеинов имеют похожие спектры (рис. 4), характерные для неупорядоченной структуры с присутствием небольшой доли других структур.

Разностные спектры показывают, что уменьшение интенсивности сигнала на 198-200 нм (и соответственный рост на 222 нм) в ряду WT>C0=C30>C0-208>C (олигомеры) и WT>C0=C0-208>=C30>C208 (мономеры) могут быть обусловлены разрушением спирали типа полипролин II (PPII). Если считать, следуя [Gangnard et al., 2007], что указанные изменения в спектре бета-казеина отражают образование более упорядоченной и менее гидратированной структуры, то из спектров на рис. следует, что наибольшей структурированностью обладает мутант C208, а наименьшей – WT, как в димерной, так и в мономерной формах. Одинаковую степень внутренней упорядоченности имеют димеры C0 и C30, а среди мономеров – C0, C30 и C0-208. В определенной степени, такой вывод соотносится с положением максимума флуоресценции для этих белков.

MRW, град*см *дмоль Рис. 4. Спектры КД для бета-казеина дикого типа и его модифицированных форм (температура 10°С). А – мономерные формы, Б – олигомерные формы.

При повышении температуры в спектрах КД рекомбинантных белков происходит уменьшение интенсивности минимума при 198-200 нм и рост глубины минимума при 222 нм. Наличие изодихроической точки указывает на равновесный переход между двумя состояниями. Разностные спектры между 10°C и 50°C имеют форму, характерную для структуры PPII (рис.5), и свидетельствуют, что повышение температуры сопровождается разрушением участков левой спирали PPII.

В целом, температурные изменения в спектрах КД отражают, преимущественно, MRW, град*см *дмоль - - Рис. 5. Спектры КД бета-казеина дикого гидрофобный домен (рис. 6). Играют ли типа при разных температурах. какую-то роль образующиеся при этом как столь же интенсивные изменения вторичной структуры протекают и в мономерной форме.

Рис. 6. Содержание элементов вторичной структуры в мономерных (А) и олигомерных (Б) формах модифицированных рекомбинантных бета-казеинов.

Физико-химические свойства бета-казеинов в водно-этанольных растворах.

2.3.1. Самоассоциация нативного бета-казеина в водно-этанольных растворах. Добавление этанола значительно видоизменяет температурные зависимости мицеллообразования бета-казеина, влияя как на размер ассоциатов, так и на температуру перехода; причем эти эффекты зависят от концентрации белка. В растворах с концентрацией казеина 0.5 мг/мл (рис. 7А) небольшие добавки этанола Dгидр, нм Рис. 7. Температурная зависимость гидродинамического диаметра частиц нативного бетаказеина в растворах с содержанием этанола 0-50% v/v. Концентрация белка 0.5 мг/мл.

ния. При дальнейшем нагреве мицеллы распадались до мономеров; причем температура распада мицелл понижалась с увеличением концентрации спирта. Это приводило к сужению температурного интервала существования мицелл, а при концентрации этанола 5 – 10% бета-казеин мицелл не образовывал. При дальнейшем увеличении содержания спирта (рис. 7Б) вновь наблюдалась самоассоциация белка, но температура разрушения мицелл понижалась до 10 – 20°С, а температура мицеллообразования, по-видимому, смещалась в область отрицательных значений.

Повышение концентрации казеина до 2.5 мг/мл (данные не представлены) способствовало большей стабильности мицеллярных структур, и ассоциаты белка существовали во всем диапазоне концентраций спирта. При этом температурные границы образования и распада мицелл изменялись аналогично описанному выше. С MAX, нм положения максимума флуоресценции в водно-этанольных (0-50% Характер изменения положения v/v) растворах бета-казеина. Концентрация максимума флуоресценции триптофана данным динамического светорассеяния по мицеллообразованию бета-казеина в водных и водно-спиртовых растворах.

2.3.2. Влияние растворителя на вторичную структуру бета-казеина.

Круговой дихроизм. Спектры КД раствора нативного бета-казеина в буфере имеют глубокий минимум при 198 нм и более слабое плечо в области 220 – 240 нм (рис. 9А), характерные для преимущественно неупорядоченных белков [Woody, MRW, град*см *дмоль Рис. 9. Спектры КД растворов нативного бета-казеина (0.5 мг/мл) в буфере при различных температурах (А) и в смеси вода-этанол с содержанием спирта 0 – 50% при температуре 10°С (Б).

Наличие и положение изодихроической точки указывает, что нагрев вызывает переход между двумя структурными состояниями: спираль PPII переходит в неупорядоченную конформацию [Drake et al., 1988; Woody, 1992; Toumadje, Johnson, 1995; Soulages et al., 2002]. Разностный спектр между 10 и 60°С также имеет форму и положение экстремумов, характерные для спирали PPII.

Анализ спектров КД водно-этанольных растворов бета-казеина показал, что с ростом концентрации спирта изменения в спектрах немонотонны, изодихроичная точка отсутствует (рис. 9Б). Разностные спектры малоинтенсивны и по форме соответствуют приросту альфа-спиральной структуры. Начиная с 20% этанола, в спектрах появляются признаки бета-структуры.

В интервале 40-50% этанола вновь начинает превалировать альфа-спиральная структура. Расчет доли вторичных структур, выполненный по спектрам КД (рис. 10), согласуется с проведенным качественным анализом и показывает рост структурированности бета-казеина по мере увеличения содержания этанола, хотя различные элементы вторичной структуры меняются по-разному. Анализ спектров КД бета-казеина в водных и водно-спиртовых растворах при нагреве до 60°С также показывает рост структурированности (данные не приводятся). Ранее авторы [Farrell et al., 2001] интерпретировали температурные изменения спектров КД бета-казеина именно таким образом.

Общий рост упорядоченных структур по мере добавления спирта представляется естественным, поскольку увеличение гидрофобности растворителя должно способствовать образованию внутрибелковых водородных связей. Однако содержание, отн.ед.

спираль структура поворот неупорядоченная Рис. 10. Содержание вторичных структур в растворах нативного бета-казеина (0. мг/мл) при температуре 10°С. Концентрация этанола 0, 1, 10, 15, 20, 30, 40 и 50%.

(рис. 11) по модели двух состояний дает значение высокотемпературного предела эллиптичности -5638±378 град*см2/дмоль, весьма близкое величине - град*см2/дмоль, соответствующей эллиптичности для полностью неупорядоченной структуры [Park et al., 1997].

MRW, град*см *дмоль - Рис. 11. Температурная зависимость некоторой концентрацией спирта, эллиптичности при длине волны 222 нм для 0.5 мг/мл растворов бета-казеина в водноИнфракрасная спектроскопия.

этанольных растворах. Штриховая линия отмечает уровень эллиптичности - град*см2/дмоль.

привлечение дополнительных структурных методов. Мы провели сравнение изменений в инфракрасных спектрах при нагреве водных и водно-спиртовых растворов нативного бета-казеина с изменениями в спектрах модельных соединений (полипролин и полиаланин), в отношении температурного поведения структуры и гидратированности которых имеются более определенные сведения, чем в отношении бета-казеина. Сопоставление показало, что при нагреве водных растворов бетаказеина имеют место два параллельных процесса: распад элементов спирали PPII с переходом в гидратированную неупорядоченную структуру и дальнейшая дегидратация последней (спектры не приводятся).

Спектральные изменения бета-казеина в смеси вода : этанол (20%) в два раза интенсивнее, чем в буфере (рис. 12А). На разностных температурных спектрах казеина в водно-спиртовом растворе проявляются две однонаправленные компоненты – 1627 и 1680 см-1, что является характерным признаком бета-структуры.

Температурная зависимость (рис. 12Б) спектральных изменений бета-казеина на частоте 1627 см-1 указывает на слабую кооперативность плавления бета-структуры с температурой полуперехода 33.6 ± 0.8°С. Зависимость интенсивности поглощения для бета-казеина в буфере показывает значительно более слабые и разнонаправленные изменения. Первоначальный рост и последующий спад обусловлены наложением двух близких компонент – спирали PPII и неупорядоченной, температурная эволюция которых неодинакова. Таким образом, качественный анализ ИК-спектров свидетельствует, что молекула казеина в 20% растворе этанола содержит значительную долю бета-структуры и обладает более компактной конформацией, чем в буфере. При нагреве происходит распад бетаструктуры с образованием неупорядоченной структуры, что подтверждает сделанное ранее заключение в отношении температурной эволюции спектров КД.

поглощение Рис. 12. Характеристика изменений вторичной структуры бета-казеина методом ИКспектрометрии. А – Температурные разностные спектры растворов бета-казеина в водном буфере (сплошная линия) и в 20% растворе этанола (штриховая линия). Спектры нормированы на интенсивность в максимуме полосы амид 1. Б – Температурные зависимости интенсивности на частоте 1627 см-1 в спектрах казеина в водном буфере (светлые символы) и в 20% растворе этанола (темные символы).

2.3.3.Самоассоциация рекомбинантного бета-казеина С0-208 в водноэтанольных растворах. Исследования самоассоциации рекомбинантных бетаказеинов в водно-этанольных растворах было выполнено на двойном мутанте С0-208, который в водной среде имел ярко выраженные отличия по ассоциативным свойствам от других бета-казеинов. В водно-этанольных смесях bCN С0-208 сохранял свои Dгидр, нм Рис. 13. Температурная зависимость гидродинамического диаметра частиц рекомбинантного бета-казеина C0-208 в растворах с содержанием этанола 0-50% v/v. Концентрация казеина 0.5 мг/мл.

характерные свойства вплоть до 15% содержания этанола. В этих системах во всем изученном интервале температур 5-80°С bCN С0-208 находился в мицеллярном состоянии, хотя размер мицелл при низких температурах существенно зависел от содержания этанола (рис. 13А). Дальнейшее повышение содержания спирта приводило к разрушению мицелл при высоких температурах, а при максимальном содержании спирта, 50%, температурный интервал существования мицелл существенно сужался (рис. 13Б).

2.3.4. Модель ассоциации бета-казеина в водно-этанольных растворах.

Основываясь на данных литературы о границах концентрационных интервалов различных микроструктур в водно-этанольных растворах [Onori, 1988; D’Angelo et al., 1994; Sato et al., 1999; Wakisaka, Matsuura, 2006], мы предлагаем модель самоассоциации бета-казеина в водно-этанольных растворах. Добавление спирта приводит к образованию клатратных структур, представляющих собой одиночные молекулы спирта, окруженные молекулами воды, что эквивалентно связыванию каждой молекулой спирта 14-20 молекул воды [Sato et al., 1999]. В интервале мольных долей спирта Х2 = 0 – 0.032 (0 – 10% этанола) при низких температурах существует достаточно молекул воды не связанных со спиртом и образующих непрерывную трехмерную сетку водородных связей, для гидратации гидрофобных групп белка, что препятствует его ассоциации (рис. 14). Нагрев ослабляет водородные связи воды и уменьшает энтальпийный вклад гидрофобной гидратации [Привалов, 1987], что приводит к мицеллизации казеина. При дальнейшем росте температуры в этом интервале концентраций растет и доля молекул спирта, участвующих в предпочтительной сольватации белка, что приводит к уменьшению размера мицелл и Dгидр, нм 0,00 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0, Рис. 14. Зависимость среднего гидродинамического диаметра частиц нативного бета-казеина от мольной доли этанола при температурах 5-60°С.

концентраций нагрев разрушает водноспиртовую структуру и облегчает взаимодействие молекул воды и этанола с белком, что приводит к распаду мицелл и переходу бета-казеина в мономерное состояние.

При Х2 > 0.18 (>50%) дисперсное состояние молекул воды способствует непосредственному взаимодействию спирта и гидрофобных белковых групп, приводя к мономеризации казеина и резкому росту его спиральности.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что температурозависимая ассоциация бета-казеина в водно-этанольных растворах протекает принципиально различным образом в области малых и больших концентраций спирта и может быть объяснена на основе существующих представлений о микрофазном расслоении смешанного водно-спиртового растворителя.

Влияние внесенных модификаций в структуру бета-казеина на его шапероноподобные свойства.

2.4.1. Влияние на тепловую денатурацию АДГ и каталазы. Для исследования шапероноподобных свойств рекомбинантных бета-казеинов использовали тест-систему, основанную на торможении агрегации АДГ и каталазы, индуцированной тепловым воздействием. Установлено, что все исследованные формы бета-казеина проявляли шапероноподобное действие, ограничивая агрегацию АДГ и каталазы, причем их активность возрастала с ростом молярного соотношения бета-казеин/целевой белок (рис. 15). Молекулярный механизм действия казеинов, очевидно, аналогичен механизму классических шаперонов, когда блокируются шапероноподобная активность, % соотношения казеинов к белковому субстрату: А – каталаза; Б – АДГ.

экспонированные в растворитель гидрофобные области частично развернутого целевого белка. Бета-казеин, как и малые белки теплового шока, имеет гибкую, слабо упорядоченную структуру с протяженными гидрофобными участками, что может способствовать его взаимодействию с разворачивающимся целевым белком, приводя к формированию стабильных комплексов. Высоко сольватированная полярная область бета-казеина, возможно, является важной в поддержании растворимости комплекса с целевым белком. Очевидно, что отличия исследованных мутантных форм бета-казеина в уровне шапероноподобной активности связаны с различием в их структурной организации и амфифильных свойствах.

2.4.2. Каталитическая активность АДГ в присутствии бета-казеинов.

Несмотря на то, что в контроле (буферный раствор) при температуре, превышающей температуру денатурации, АДГ теряла часть активности (рис. 16, вставка), установлено, что в присутствии бета-казеина активность фермента может сохраняться отн. активность АДГ, % формы бета-казеина Вероятно, в мицеллярной форме бетаРис. 16. Активность АДГ в присутствии казеин блокирует активные центры различных форм бета-казеина при 70С (за фермента, ингибируя, тем самым, его 100% принята активность фермента в каталитическое действие. Таким образом, отсутствии бета-казеинов при 70С). На обладая шапероноподобной активностью вставке представлена зависимость Vo от температуры для АДГ в отсутствии бетаи его модифицированные формы могут казеинов.

температурах выше температуры денатурации.

2.4.3. Антиген-связывающая способность IgG в присутствии бета-казеина.

Антиген-связывающая способность антител коррелирует непосредственно с конформационной стабильностью белковой молекулы [Li et al., 2005, 2006]. В связи с денатурированный белок, % Рис. 17. Общее количество IgG (%), температурных обработках. Присутствие потерявших иммунореактивность вследствие казеинов и белков молочной сыворотки разрушения нативной пространственной в растворе антител эффективно организации. Сравнение различных концентраций защитного агента – нативного бета-казеина. 20* – точка без преинкубации раствора антител.

соотношениях белок/IgG. При температуре 60-80°C снижение уровня детектируемого IgG коррелировало с ростом температуры. Активных концентраций антител практически не было зафиксировано при температуре 75-80°C.

Очевидно, потеря антиген-связывающей способности IgG, последовавшая за воздействием описанных условий, происходит в основном благодаря конформационному разворачиванию молекулы иммуноглобулина. Способность сывороточных белков молока и казеинов стабилизировать антитела может быть объяснена различными молекулярными взаимодействиями. Защитный эффект казеинов, возможно, имеет место благодаря наличию протяженных гидрофобных участков в белковой молекуле, которые подобно шаперонам за счет гидрофобных взаимодействий с развернутой молекулой поддерживают конформацию IgG. С другой стороны свойства БСА (64 кДа), вероятно, могут быть обусловлены большой молекулярной массой белка и присутствием достаточно крупных молекул в растворе с антителами, так называемым, краудинг (crowding) эффектом [Chebotareva et al., 2004; Chebotareva, 2007; Jeschke, Uhrmacher, 2008; Miyoshi, Sugimoto, 2008].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из фундаментальных задач биоинженерии и молекулярной биологии является установление связи пространственной организации биомакромолекул с их функциональными свойствами, а также структурой и физико-химическими свойствами индивидуальных растворителей для направленного получения белков с заданными характеристиками.

В настоящей работе для исследования структуры и агрегационных свойств рекомбинантных и нативного бета-казеинов в водных и водно-этанольных растворах применен комплекс физико-химических методов (динамическое светорассеяние, флуоресцентная и инфракрасная спектроскопии, спектроскопия кругового дихроизма). Исследована шапероноподобная активность бета-казеинов по отношению к термо-индуцированной агрегации ряда целевых белков.

Обнаружено, что образование внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей, помимо влияния на вторичную структуру, оказывает воздействие на ассоциативные свойства бета-казеина, а также на его способность взаимодействовать с различными белками-субстратами. Точечное введение цистеина в полипептидную цепь бета-казеина способствует росту упорядоченности его вторичной структуры.

Наибольшее влияние оказывают замены, затрагивающие гидрофобный домен.

Дисульфидные связи, в особенности между гидрофобными участками полипептидной цепи, и, как следствие, димеризация и олигомеризация способствуют самоассоциации рекомбинантных белков.

Показано влияние микрогетерогенности структуры смешанного растворителя на вторичную структуру белка и его коллоидное состояние. В исследуемом интервале концентраций спирта (0 – 50% v/v) бета-казеин претерпевает переход между различными структурными состояниями. Наблюдаемые переходы коррелируют с изменениями в характере межмолекулярных взаимодействий в бинарном растворителе. В области низких концентраций спирта основным фактором, определяющим структуру и мицеллообразование бета-казеина, является снижение качества воды как растворителя вследствие образования ее молекулами клатратной структуры вокруг молекул спирта. Клатратная структура раствора препятствует непосредственному взаимодействию молекул белка и спирта. Нагрев разрушает клатраты и способствует мономеризации белка. В области высоких концентраций этанола клатратная структура воды разрушается и уже при низких температурах преобладает непосредственное взаимодействие белка с молекулами спирта, дестабилизирующее мицеллы и вызывающее резкий рост вторичных структур в белке. Полученные результаты способствуют пониманию факторов, управляющих процессами мицеллизации казеинов.

Результаты исследования влияния рекомбинантных бета-казеинов на стабилизацию структуры и модуляцию активности белков-субстратов демонстрируют приобретение этими белками повышенной устойчивости к денатурирующим воздействиям температуры. Кроме того, повышение температурной стабильности ферментов сопровождается изменением их каталитической активности в сторону, как ингибирования, так и активации, что зависит от структуры и концентрации используемого бета-казеина. Результаты, полученные на основе анализа иммунореактивности антител методом непрямого ИФА, демонстрируют способность бета-казеина поддерживать конформацию и сохранять антиген-связывающую способность моноклональных IgG. Обнаруженный эффект согласуется с предыдущими сообщениями о защитном влиянии компонентов молока, замедляющих индуцированную нагреванием денатурацию и агрегацию IgG [Chen, Chang, 1998;

Chen et al., 2000; Ando et al., 2005; Trujillo et al., 2007]. Выявленные механизмы воздействия бета-казеинов на функциональную активность и стабильность белковых субстратов позволяют целенаправленно модифицировать структуру белков в промышленных препаратах с целью повышения их устойчивости и исходной каталитической активности в широком диапазоне температур и рН.

ВЫВОДЫ

Структура и ассоциативные свойства модифицированных форм бета-казеина существенно зависят от места локализации введенного цистеинового остатка.

Мицеллярные ассоциаты мономерных форм, содержащих цистеин в начале полипептидной цепи, оказываются менее устойчивыми к температурному воздействию, тогда как мицеллы, образованные олигомерными формами модифицированных бета-казеинов сохраняют стабильность при высоких температурах.

Точечное введение цистеина способствует росту внутренней упорядоченности белка, при этом наибольшее влияние на вторичную структуру оказывают замены, затрагивающие гидрофобный домен пептидной цепи бета-казеина.

Изменения вторичной структуры и ассоциативных свойств бета-казеина в водноэтанольных растворах определяются структурой растворителя, которая зависит от его состава и температуры. Содержание элементов вторичных структур и размеры мицелл бета-казеина коррелируют с концентрационными границами существования различных микрогетерогенных структур в смешанном растворителе. Показано наличие верхней и нижней границ температурного интервала самоассоциации бета-казеина. В отличие от существующего мнения о спирализации бета-казеина при высоких температурах, достоверно установлено, что увеличение температуры приводит к росту содержания неупорядоченной структуры.

На модельных системах (тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы, каталазы, иммуноглобулина G) установлено защитное действие бета-казеина, направленное на торможение процесса агрегации и сохранение частичной ферментативной активности целевого белка. Показано, что шапероноподобная активность рекомбинантных бета-казеинов существенно зависит от места локализации цистеинового остатка и структурного состояния белка.

Впервые показано, что в условиях температурного стресса все олигомерные формы бета-казеина в молекулярном состоянии проявляют значительный шапероноподобный эффект по отношению к каталитической активности алкогольдегидрогеназы, а в мицеллярной форме этого эффекта не наблюдается.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК 1. Шапероноподобная активность -казеина и термостабильность алкогольдегидрогеназы / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова, Н.Е. Гоголева, Д.А.

Файзуллин, T. Эртле, Ю.Ф. Зуев // Биоорганическая химия. – 2012. – Т. 38, № 2. – С. 223–228.

2. Мицеллообразование бета-казеина в водно-этанольных растворах / Т.А. Коннова, Д.А. Файзуллин, T. Эртле, Ю.Ф. Зуев // Доклады Академии Наук. – 2013. (в печати).

Работы, опубликованные в материалах конференций 3. Шапероноподобная активность бета-казеина и влияние модификаций первичной структуры / С.С. Горина, Н. Е. Мухаметшина, Т.А. Коннова и др. // Тезисы докладов / Изд-во Пущинского НЦ РАН. – Пущино, 2008. – С. 15-16.

шапероноподобную активность / Н.Л. Захарченко, Н. Е. Мухаметшина, Т.А.

Коннова и др. // Сб. трудов / Изд-во Арта. – Новосибирск, 2008. – С. 273.

5. Структура и шаперонная активность рекомбинантных форм бета-казеина / Ю.Ф.

Зуев, Т.А. Коннова, Н.Л. Захарченко и др. // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. – Казань, 2009. – С. 72.

6. Структура рекомбинантных мономерных и олигомерных форм бета-казеина / Н.Л.

Захарченко, Д.А. Файзуллин, Ю.В. Гоголев, Н.Е. Мухаметшина, Т.А. Коннова, T.

Haertl, Ю.Ф. Зуев // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН.

– Казань, 2009. – С. 166.

7. Chaperone-like activities and structural properties of different molecular forms of betacasein / N.E. Mukhametshina, N.L. Zakhartchenko, T.A. Konnova et al. // Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. – Prague, Czech Republic, 2009. – Р. 157.

8. Коннова, Т.А. Температуро-зависимая диссоциация мицелл бета-казеина в водноэтанольных растворах / Т.А. Коннова, Ю.Ф. Зуев // Тезисы докладов / Из-во Казанского государственного университета. – Казань, 2010. – С. 29.

9. Захарченко, Н.Л. Структурные различия природной и рекомбинантной форм бетаказеина. Метод флуоресценции / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова // Тезисы докладов / Из-во Казанского государственного университета. – Казань, 2010. – С.

10. Konnova, Т.А. Influence of ethanol on beta-casein micellar organization and colloidal stability / T.A. Konnova, D.A. Fayzullin, N.L. Zakhartchenko et al. // Abstracts / Wiley Blackwell, FEBS. – Torino, Italy, 2011. – P. 113.

11. Взаимосвязь структуры и шапероно-подобной активности бета-казеина / Н.Л.

Захарченко, Т.А. Коннова, Н.Е. Гоголева, и др. // Тезисы докладов / Изд-во Карельского НЦ РАН. – Петрозаводск, 2011. – С. 221.

12. Структурная организация и стабильность мицелл бета-казеина в водно-этанольных растворах / Т.А. Коннова, Д.А. Файзуллин, Н.Л. Захарченко и др. // Тезисы докладов / Изд-во Карельского НЦ РАН. – Петрозаводск, 2011. – С. 371.

13. Защитные свойства бета-казеина по отношению к белкам в стрессовых условиях / Н.Л. Захарченко, Т.А. Коннова, Н.Е. Гоголева и др. // Тезисы докладов / Изд-во Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. – Нижний Новгород, 2011. – С. 267.

14. Бета-казеин – природный амфифил: структура, самоассоциация, шапероноподобные свойства / Т.А. Коннова, Н.Л. Захарченко, Д.А. Файзуллин и др. // Тезисы докладов / Из-во «Печать-Сервис-XXI век». – Казань, 2011. – С. 83.

15. Шапероноподобная активность бета-казеина в условиях температурного и химического стрессов / Т.А. Коннова, Н.Л. Захарченко, Н.Е. Гоголева и др. // Тезисы докладов / Изд-во «ФизтехПресс» КФТИ КазНЦ РАН. – Казань, 2011. – С.

16. The role of beta-casein micellar network in its chaperone-like activity / T. A. Konnova, N. L. Zakhartchenko, N. E. Gogoleva et al. // Abstracts / Universit Paris Diderot. – Paris, France, 2012. – Р. 51.

17. Ферментативная активность липазы Candida Rugosa в присутствии мицелл бетаказеина / Н.Л. Захарченко, Л.Р. Богданова, Т.А. Коннова, Ю.Ф. Зуев // Тезисы докладов / Изд-во Нижегородского государственного университета им.

Н.И.Лобачевского. – Нижний Новгород, 2012. – С. 112.