МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени М.В. ЛОМОНОСОВА
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи
ГРУМ-ГРЖИМАЙЛО
Ольга Алексеевна
МИКРОМИЦЕТЫ ЗАБОЛАЧИВАЮЩИХСЯ ВОДОЕМОВ
ПОБЕРЕЖЬЯ КАНДАЛАКШСКОГО ЗАЛИВА БЕЛОГО МОРЯ
Специальность 03.02.12 – микология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2012
Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, на Беломорской Биологической станции имени Н.А. Перцова МГУ имени М.В. Ломоносова, в лаборатории генетики университета г. Вагенинген, Нидерланды кандидат биологических наук
Научный руководитель Биланенко Елена Николаенва доктор биологических наук, проф.
Официальные оппоненты Марфенина Ольга Евгеньевна кандидат биологических наук Семёнова Татьяна Александровна
Ведущая организация Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов»
Защита диссертации состоится 7 декабря 2012 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет (аудитория М-1), т/факс: (495) 939-39-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
Автореферат разослан 2 ноября 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук М.А. Гусаковская Актуальность исследования. Болота побережья Кандалакшского залива Белого моря уникальны по происхождению. Они образуются путем отделения от моря из-за быстрого поднятия суши (0.5 см/год), дальнейшего опреснения и заболачивания и др., 2011). Эти процессы сопровождаются (Пантюлин изменением свойств данных водоемов и условий обитания в них живых организмов, поэтому по мере отдаления от моря происходит закономерная смена морской биоты на пресноводную и характерную для торфяников. Грибы, выполняющие в любых сообществах важную роль деструкторов, симбионтов, паразитов и патогенов, несомненно, сопутствуют эволюции отшнуровывающихся от моря водоемов (их число на побережье Кандалакшского залива оценивается от одной до нескольких сотен), однако в литературе практически отсутствуют сведения, касающиеся микобиоты подобных экосистем.
Конечной стадией развития заболачивающихся водоемов исследованного региона являются верховые болота, доминирующая растительность которых – сфагновые мхи. Болота характеризуются неблагоприятными для развития организмов условиями анаэробиоза, низких температур, повышенной кислотности торфообразования невозможно понять, если не учитывать деятельность микроорганизмов-деструкторов, бактерий и грибов, способных функционировать в таких условиях (Thormann et al., 2004a, 2006, 2007; Панкратов и др., 2005;
Качалкин, 2010). Изучению грибов в торфяниках посвящен ряд работ, однако отсутствие целостной картины микробиологической деструкции обусловлено недостатком данных как по биоразнообразию грибных сообществ в разных типах торфяных почв, особенно северных районов, так и по функциональной значимости отдельных видов грибов на разных этапах сукцессии (ГрумГржимайло и др., 2010). Исследование специфики структуры сообщества микромицетов, формирующегося в разновозрастных торфяниках, составляет необходимое звено в изучении процесса торфообразования в целом.
заболачивающихся водоемов, отражающих практически все стадии развития болот в регионе исследования, с использованием морфологических, культуральных и молекулярных данных.
Цель и задачи исследования. Цель работы – изучить микобиоту разных компонентов заболачивающихся водоемов побережья Кандалакшского залива Белого моря.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Характеризовать таксономическую структуру сообщества грибов разных компонентов болот, находящихся на разной высоте над уровнем моря, с использованием морфолого-культуральных и молекулярных методов.
Выяснить положение видов неясной таксономии в общей системе грибов с использованием подходов молекулярной филогении.
Определить количественное содержание зачатков культивируемых грибов во всех компонентах водоемов разной степени заболачивания.
Создать коллекцию культур микромицетов из исследованных экотопов.
Выявить закономерности распределения микромицетов по профилю разных компонентов болот различной степени удаленности от моря и заболачивания.
Изучить образцы сфагновых мхов разной степени деструкции с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) и молекулярными методами.
торфяниках видов грибов при разных значениях рН.
Исследовать особенности роста часто встречающихся видов грибов на средах с разными источниками углерода в кислых и щелочных условиях.
Исследовать способность к росту и особенности морфологии видов грибов из торфяников верховых болот в условиях дефицита кислорода.
культивируемых грибов торфа и ила прибеломорских болот разной степени опреснения и заболачивания. Использование наряду с морфологокультуральными молекулярных данных позволило впервые установить таксономическую структуру сообщества грибов, включая стерильные морфотипы, среди которых значительная доля принадлежит базидиомицетам. Обнаружены новые для науки таксоны грибов. Новые данные получены в отношении распределения грибов в зависимости от стадии формирования торфяника. Для оз.
Кисло-Сладкое получены микологические данные, характеризующие его как водоем переходного типа, сохраняющий связь с морем. Обнаружение обильного развития грибов на поверхности разлагающихся участков сфагнума и присутствия ДНК грибов в тканях без видимых повреждений, возможности роста на соединениях, преимущественно входящих в состав мхов, развития при различных значениях рН среды, а также в условиях гипоксии, позволило расширить представление об участии грибов в деструкции разных компонентов сфагновых болот по всему профилю торфяника.
Практическая значимость. Создана и поддерживается коллекция грибов из торфа и ила сфагновых болот, включающая группу грибов - деструкторов сложных полимерных соединений, а также группу энтомопатогенных видов грибов. На базе коллекции возможен поиск потенциальных объектов для биотехнологии. Представленная характеристика видового состава и экологии грибов в водоемах на разных этапах заболачивания позволяет оценить их роль и деструкторов органического материала торфа и ила.
Ацидофильные и ацидотолерантные грибы могут быть использованы как энтомопатогенные виды – для разработки средств биозащиты от насекомых.
экосистемах могут быть использованы при чтении курса лекций по экологии грибов.
Секвенированные 334 участка ДНК 219 штаммов грибов (ITS, LSU, SSU rDNA) депонированы в GenBank NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), где им присвоены номера: JQ768386-JQ768405, JQ780611-JQ780667, JX507628JX507735, JX535036-JX535187.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на Европейском конгрессе микологов «XV Congress of European Mycologists» (Санкт-Петербург, Россия, 2007); 2-м и 3-м Съездах микологов России (Москва, Россия, 2008, 2012);
научной конференции, посвященной 70-летию Беломорской биологической станции им Н.А. Перцова (ББС, Россия, 2008); Азиатском конгрессе микологов «XII Congress of Asian Mycologists and XII International Marine and Freshwater Mycology Symposium) (Taichung, Taiwan, Университета г.Вагенинген (Wageningen, The Netherlands, 2011) и кафедры Микологии и альгологии Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, Россия, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы и 21 приложений. Работа изложена на 236 страницах, содержит 21 таблицу и 78 рисунков, приложения с 21 рисунком и 12 таблицами.
Список литературы включает 170 источников, из них 107 на иностранных языках.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы В обзоре литературы приведены сведения по распространению, типам и особенностям болот. Проведен подробный анализ современного состояния проблемы изучения сообществ микромицетов верховых болот в целом и результатов микологических исследований торфяников и почв Прибеломорской таежной зоны. Представлены материалы о роли грибов в деструкции разных слоев торфяников, рассмотрены особенности экологии отдельных видов.
Приведены данные, касающиеся способности микромицетов к росту в условиях гипоксии. Обсуждается значение торфяников в глобальных процессах биосферы и актуальность исследования болотных экосистем.
Глава 2. Материалы и методы сфагнума, торфа, ила, почвы и прибрежного грунта водоемов разной степени заболоченности, расположенных на разной высоте относительно уровня моря и удаленности от него, в окрестностях Беломорской Биологической Станции (ББС) им. Н.А. Перцова (66°34’N, 33°08’E) МГУ (рис. 1). Для анализа микобиоты было отобрано 117 образцов в июне-августе 2007-2010 гг. Образцы торфа около озер Верхнее, Круглое и Ершовские стерильно отбирали с помощью пробоотборочного бура в скважинах через каждые 0.5м снизу вверх, начиная с максимальной глубины. В деятельном слое (до 0.5м) ножом отбирали образцы торфа через каждые 0.1м, очеса, живой части сфагнума, почвы из разных слоев почвенных разрезов. Образцы придонного глубинного и поверхностного ила отбирали с разной глубины каждые 0.5м стерильно методом дайвинга и фридайвинга, с поверхности дна и с глубины ~0.3м в каждой точке отбора (табл. 1, 2). До посева образцы хранили в холодильнике при температуре +4С в течение 1-2 суток. Были собраны доминирующие виды сфагнума для определения, части живых мхов разной степени деструкции для фиксации и исследования с помощью сканирующего электронного микроскопа и анализа ДНК грибов.
Рис. 1. Расположение исследованных болот на п-ве Киндо: 1 – оз. Верхнее (87 м над уровнем моря); 2 – оз. Круглое (27.5 м над ур. моря), 3 – оз. Ершовское Верхнее (4 м над ур. моря), 4 – оз. Ершовское Нижнее (3 м над ур. моря), 5 – оз.
Кисло-Сладкое (1-2 м над ур. моря).
Таблица 1. Краткая характеристика образцов из торфа и ила 4-х водоемов Таблица 2. Характеристика образцов из разных компонентов оз. Кисло-Сладкое Анализ грибов в образцах: посев, учет, изоляция, идентификация. Для выделения и культивирования микромицетов образцы методом разведения сеяли на стандартные и селективные агаризованные среды (табл. 3). Учет выросших колоний, изоляцию на пробирки с питательной средой и посев на диагностические среды проводили поэтапно в течение 1-2 недель инкубации посевов при температуре 21-23С.
Таблица 3. Среды для выделения и культивирования микромицетов стандартные селективные Микроскопировали и фотографировали при помощи световых микроскопов марок Микмед-2, Leica DM 2500, Carl Zeiss Axioskop 40 FL. Идентификацию грибов по морфолого-культуральным признакам проводили с использованием отечественных и зарубежных определителей. Для молекулярной идентификации анализировали нуклеотидные последовательности регионов ITS1-5.8S-ITS2, 28S и 18S рДНК. Амплификацию региона ITS из чистых культур грибов проводили с использованием праймеров ITS1F и ITS4R, региона LSU с праймерами LR0R и LR9, региона SSU с праймерами NS1 и NS8. Для секвенирования использовали праймеры, с которыми амплифицировали, а также LR7, NS4 (Vilgalys et al., 1990;
White et al., 1990). Амплификацию и секвенирование региона ITS ДНК грибов из тканей сфагнума проводили с праймерами NSA3, NLC2, NSI1, NLB4 (Martin et al., 2005). Обрабатывали последовательности с использованием пакета программ Lasergene Package 7.1 (DNA Star), сравнивали их с данными GenBank (NCBI, Blast similarity search) и депонировали.
Названия таксонов и их положение в системе приводятся в соответствии с изданием Словаря грибов Эйнсворта и Бисби (Ainsworth and Bisby’s Dictionary of http://www.indexfungorum.org/.
образцов, где вид был встречен, к общему числу образцов (%). Удельное обилие рода определяли как процентное отношение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) данного рода к общему количеству КОЕ всех родов, видовое разнообразие рода определяли как число видов данного рода в торфянике.
Обсчет данных производили в программе Microsoft Office Excel 2007. Для оценки биоразнообразия с помощью программы PAST 2.14 (Hammer et al., 2001) рассчитывали индексы альфа-разнообразия (Шеннона, выровненности, (коэффициенты Сьёренсена и Жаккара) (Лебедева и др., 1999; Zak et al., 2004).
Построение филогенетических деревьев проводили на базе частичных последовательностей участков ITS и LSU. Нуклеотидные последовательности для построения филогенетических деревьев были использованы из материалов статей с описаниями и данных NCBI. Для выравнивания, обработки полученного набора сиквенсов и сшивки разных участков ДНК использовали программы MAFFT 6 (Katoh et al., 2009), MEGA 4 (Tamura et al., 2007), BioEdit (Hall, 1999), Mesquite (Maddison et al., 2010). Тестировали наборы сиквенсов каждого гена для выбора наилучшей эволюционной модели, обсчитывали по принципу максимального правдоподобия (maximum likelihood) (ML) для байесовского вывода (Bayesian inference) (BI), по информационному критерию Акаике (Akaike Information Criterion) (AIC) в программе jModelTest 0.1.1 (Posada, 2008). Байесовский анализ осуществляли в программе MrBayes 3.1.2 (Ronquist et al., 2005), ML – в GARLI 2. (Zwickl, 2008), NJ – в MEGA 4. Редактировали с использованием программ MrEnt v.
2.2 (Zuccon et al., 2010), TreeGraph 2 (Stver et al., 2010) и Adobe Illustrator CS5.1.
Исследование сфагнума разной степени деструкции в СЭМ. Сфагнум фиксировали в 2.5% растворе глутар альдегида в фосфатном буфере, обезвоживали в серии растворов этанола (30%50%70%96%) и в ацетоне, с последующим высушиванием в критической точке и напылением углеродом и металлом. Исследовали образцы с помощью сканирующего электронного микроскопа марки Jeol (JSM – 6380, Япония).
Изучение способности роста микромицетов в условиях гипоксии. На повторностях, одну из которых помещали в контейнер с газогенераторами GENbox, создающих условия гипоксии, а другую оставляли на воздухе (контроль).
Инкубирование проводили в термостате при температуре 25C в течение месяца.
Анализ линейной скорости роста грибов при разных значениях рН. В стеклянные трубки со средой СА на основе цитратного, карбонатного и фосфатного буферов со значениями рН от 3 до 10 сеяли 36 изолятов распространенных в болотах микромицетов в двух повторностях, инкубировали в течение месяца на свету при температуре 23C, регулярно отмечали край растущих колоний и анализировали полученные результаты с помощью графиков скорости роста (мм/сут), построенных в программе Excel.
Исследование особенностей роста на разных источниках углерода.
Проводили посев 36 изолятов часто встречающихся в болотах грибов на агаризованные среды с фосфатными буферами (рН 6, рН 8) в двух повторностях.
Использовали 16 углеводов, соответствующих химическому составу сфагновых мхов: глюкоза, арабиноза, ксилоза, галактоза, фруктоза, манноза, целлобиоза, сахароза, галактуроновая кислота, ксилан березовый, пектин яблочный, гуаран, целлюлоза, хитин, лигнин и таниновая кислота. Контролем служили среды без сахаров. Инкубирование и анализ результатов проводили как в предыдущем эксперименте.
Глава 3. Результаты и обсуждение культивируемых микромицетов торфа и ила заболачивающихся водоемов.
В данном разделе подробно охарактеризован видовой состав мицелиальных грибов из разных компонентов водоемов, находящихся на разных стадиях заболачивания (озера Верхнее, Круглое, Ершовское Верхнее, Ершовское Нижнее, Кисло-Сладкое). Всего изолировали 328 видов грибов, из которых 209 (64%) принадлежали отд. Ascomycota, 36 видов (11%) – отд. Basidiomycota, 10 видов (3%) – отд. Zygomycota, 73 стерильных морфотипа не идентифицировали.
Средняя численность жизнеспособных зачатков грибов составляет 102–105 КОЕ на 1 г сухой массы образца. Преобладание грибов из отд. Ascomycota за счет исследованных водоемов (рис. 2). Наибольшее число выделенных анаморфных Monoverticillata и Biverticillata-Symmetrica. Сходная закономерность отмечена и для молодых формирующихся почв в отсутствии древесной растительности (Егорова, 2012). Удельное обилие рода Penicillium в среднем составляет в торфе 29.5 %, в иле 11.5 %.
В торфе водоемов, давно потерявших связь с морем и находящихся на стадиях верховых или переходных болот, типичными (по показателям временной и пространственной частот встречаемости) были виды Penicillium spinulosum, P.funiculosum, P.glabrum, P.thomii, P.variabile, Cladosporium bruhnei, C.cladosporioides, C.herbarum, C.sphaerospermum, Beauveria bassiana, Oidiodendron griseum, Tolypocladium inflatum, Phlebiopsis gigantea, Aureobasidium pullulans и Trichoderma viride (рис. 4). Отмечены виды, известные как деструкторы сфагновых мхов (O.griseum, O.maius, O.periconioides, P.funiculosum, P.spinulosum, P.thomii). Четкой корреляции состава видов грибов с изменением глубины образцов торфа не наблюдали. Наибольшее число видов микромицетов выделено из верхних и самых глубинных слоев торфяников.
В придонном иле, в отличие от торфа, наиболее частыми были стерильные мицелии и виды Tolypocladium inflatum, Trichoderma hamatum, T.polysporum, T viride, Penicillium funiculosum, P.roseopurpureum, P.spinulosum, Aureobasidium pullulans, Sistotrema brinkmannii, Ascomycota sp., Scopulariopsis brumptii, Cadophora luteo-olivacea, Geotrichum candidum, Acrodontium crateriforme, Emericellopsis minima и Helotiales spp. Отмечены виды, характерные для морских поверхностного ила выделялось больше грибов, чем из глубинного ила.
Ниже приведен список выделенных видов микромицетов. Знаком * молекулярными методами.
ZYGOMYCOTA
i.s.: Mortierellales: Mortierellaceae: Mortierella elongata Linnem.*, M. lignicola (G.W.Martin) W. Gams et R. Moreau, M. longicollis Dixon-Stew.;
i.s.: Mucorales: Mucoraceae: Mucor circinelloides Tiegh., M. hiemalis Wehmer*, M.
racemosus Fresen.; Umbelopsidaceae: Umbelopsis isabellina (Oudem.) W. Gams, U.ramanniana (Mller) W. Gams, U. vinacea (Dixon-Stew.) Arx, Umbelopsis sp.
ASCOMYCOTA
Saccharomycetes:Saccharomycetales: Dipodascaceae: Geotrichum candidum;
Dothideomycetes:
Botryosphaeriales: Botryosphaeriaceae: Neoscytalidium dimidiatum (Penz.) Crous et Slippers;
Capnodiales: Davidiellaceae: Cladosporium antarcticum K. Schub., Crous et U.
Braun, C. bruhnei Linder, C. cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries*, C. herbarum (Pers.) Link*, C. langeronii (Fonseca, Leo et Nogueira) Vuill.*, C. sphaerospermum Penz., Cladosporium spp. (1-4)*, 5-8;
Dothideales: Dothioraceae: Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud, Sydowia polyspora (Bref. et Tavel) E. Mll.*, Dothideales sp.*;
Pleosporales: Pleosporaceae: Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Alternaria sp. 1*, sp.
2*, Dendryphiella salina (G.K. Sutherl.) Pugh et Nicot*, Phaeosphaeria sp.; i.s.:
Phoma poolensis var. verbascicola (Ellis et Kellerm.) Aa et Boerema*, Pleosporales spp. (1-5)*;
i.s.: Myxotrichaceae: Oidiodendron ambiguum Peyronel et Malan, O. echinulatum G.L.
Barron, O. griseum Robak, O. maius var. citrinum (Barron) Rice a. Currah, O.
periconioides Morrall, Oidiodendron sp.;
i.s.: Pseudoeurotiaceae: Teberdinia hygrophila Sogonov, W. Gams, Summerb. et Schroers*;
Dothideomycetes spp. 1*, 2*;
Leotiomycetes:
Helotiales: Helotiaceae: Crocicreas sp.*, Helotiaceae sp.*; Sclerotiniaceae:
Botryotinia sp.*, Botrytis cinerea Pers., Sclerotinia sp.; i.s.: Cadophora fastigiata Lagerb. et Melin*, C. luteo-olivacea (J.F.H. Beyma) T.C. Harr. et McNew*, C. malorum (Kidd et Beaumont) W. Gams*, C. melinii Nannf., Cadophora spp. 1, 2, Helotiales spp.
(1-17)*;
i.s: i.s.: Geomyces pannorum (Link) Sigler et J.W. Carmich.*;
Leotiomycetes spp. (1-6)*;
Eurotiomycetes:
Chaetothyriales: Herpotrichiellaceae: Cladophialophora humicola Crous et U. Braun, Phialophora europaea de Hoog, Mayser et Haase, P. lagerbergii (Melin et Nannf.) Conant, P. verrucosa Medlar, Phialophora sp.;
Eurotiales: Trichocomaceae: Aspergillus proliferans G. Sm., A. repens (Corda) Sacc., A. tubingensis Mosseray*, A. ustus (Bainier) Thom et Church, A. versicolor (Vuill.) Tirab., Eurotium sp.*, Penicillium aculeatum Raper et Fennellm, P. aurantiogriseum Dierckx, P. brevicompactum Dierckx, P. chermesinum Biourge, P. citreonigrum Dierckx, P. citrinum Thom, P. corylophilum Dierckx, P. decumbens Thom, P. dierckxii Biourge, P.
diversum Raper at Fennell, P. duclauxii Delacr., P. expansum Link, P. funiculosum Thom*, P. glabrum (Wehmer) Westling, P. griseofulvum Dierckx, P. implicatum Biourge, P. janczewskii K.M. Zalessky, P. multicolor Grig.-Man. et Porad., P. nalgiovense Laxa, P. purpurescens (Sopp) Biourge, P. restrictum J.C. Gilman et E.V. Abbott, P. rolfsii Thom, P. roseopurpureum Dierckx, P. rugulosum Thom, P. sclerotiorum J.F.H. Beyma, P. solitum Westling, P. spinulosum Thom*, P. thomii Maire*, P. variabile Sopp, P.
«