На правах рукописи
Ганеев Тимур Ирекович
ВЛИЯНИЕ МЕХАНОАКТИВИРОВАННОЙ АМОРФНОЙ КАЛЬЦИЕВОЙ СОЛИ
ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЁ КОМБИНАЦИИ С АНТИОКСИДАНТНЫМ
ПРЕПАРАТОМ НА ОБМЕН КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ
ИНТОКСИКАЦИИ ДИХЛОРЭТАНОМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
03.01.04 – Биохимия 14.03.03 — Патологическая физиология
Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Тюмень — 2012
Работа выполнена на кафедре биологической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации доктор медицинских наук, профессор Научные руководители:
Камилов Феликс Хусаинович кандидат медицинских наук Фаршатова Екатерина Рафаэлевна доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Базарный Владимир Викторович, ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России доктор медицинских наук, профессор Бышевский Анатолий Шулимович ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Омск).
Защита состоится « 01» марта 2012 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.02 при ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: г. Тюмень, ул. Одесская, 54.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Автореферат разослан « 31 » января 2012 года
Ученый секретарь диссертационного совета С.А. Орлов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В Российской Федерации у людей старше 50 лет диагностируется в среднем 105,9 случаев переломов проксимального отдела бедренной кости, 426,2 случаев переломов дистального отдела предплечья на 100 000 населения [О.М. Лесняк, Л.И. Беневоленская, 2010], каждую минуту происходит 7 переломов позвонков [О.М. Лесняк, 2010]. Основной причиной таких переломов является остеопороз – прогрессирующее системное метаболическое заболевание скелета, которое характеризуется снижением костной массы и нарушениями архитектоники костной ткани, приводящие к уменьшению её механической прочности и увеличению частоты переломов [Л.Я. Рожинская, 2002]. Смертность в течение первого года после перелома бедренной кости в России составляет 30%, а из выживших через год после перелома – 78%, через 2 года 65,5% нуждаются в постоянном уходе [Л.В. Меньшикова и др., 2002] и требуют значительных финансовых затрат. Остеопороз вызывает летальный исход у 1 из 1 000 жителей популяции, что сопоставимо с риском смерти от инфаркта миокарда [Э.Ю. Коцелапова и др., 2009]. В 2002 г. в США ежегодные расходы на лечение и реабилитацию больных с остеопоротическими переломами оценивались в 17,5 млрд. долларов [L.Y. Melton III, 2003]. По прогнозам экспертов затраты на лечение остеопоротических переломов и, прежде всего, шейки бедра будут проградиентно увеличиваться, и к 2025 году составят в Европе около 31,8 млрд. евро [IOF, 2006]. Не случайно остеопороз, наряду с сердечно-сосудистыми, онкологическими заболеваниями, сахарным диабетом и хронической обструктивной болезнью лёгких, относится к важнейшим социально-медицинским проблемам современности [В.К. Казимирко и др., 2006].
В отличие от других наиболее социально-значимых болезней наблюдается низкий охват нуждающихся в диагностике и лечении остеопорозом, поскольку потери минеральной плотности костной ткани (МПКТ) происходит исподволь и часто диагностируется только после переломов. В сложившейся обстановке для предупреждения неблагоприятной ситуации ведущей стратегией является своевременная диагностика и профилактика остеопороза, выявление лиц, у которых имеется высокий риск развития переломов. С этих позиций представляет интерес клинические исследования, демонстрирующие, что у пациентов с заболеваниями пародонта, приводящими к выпадению зубов, выявляются низкие показатели МПКТ [Е.Е Конопля и др., 2008; Н.В. Плескановская и др., 2008; В.Г. Атрушкевич, 2008; A.R. Mohanmod et al., 2003; Y. Watawski-Wende et al., 2005; S. GomesFilho et al., 2007]. У пациентов с остеопорозом в более, чем в 40% случаев диагностируется хронический генерализованный пародонтит, а у пациентов без такового – лишь в 12,5% [С.Д. Арутюнов и др., 2007; 2009]. Авторами продемонстрировано нарастание тяжести поражения пародонта по мере потери МПКТ периферического скелета.
Одним из малоизученных аспектов развития воспалительно-дистрофических изменений в пародонте и остеопороза являются химические загрязнители окружающей среды и производственных помещений [А.Ф.
Вербовой, 2002; Т.С. Чемикосова и др., 2003; 2004; А.Ш. Галикеева, А.И.
Булгакова, 2008; Ф.Х. Камилов и др., 2007; 2008; Э.Ю. Коцелапова и др., 2009].
Показано, что у работников химического предприятия, имеющих производственный контакт с различными хлорорганическими веществами (дихлорэтан, хлорпропан, хлорвинил, хлорпропен, дихлорпропан, эпихлоргидрин и др.) во всех возрастных группах чаще, чем у рабочих других профессий обнаруживается развитие остеопенического синдрома [Ф.Х. Камилов и др., 2007; 2008; 2009; И.А. Меньшикова и др., 2007; 2008; Л.М. Рамазанова и др., 2008; 2009]. Авторами установлено, что при хронической интоксикации дихлорэтаном в низких концентрациях наблюдается нарушения метаболизма трубчатых костей экспериментальных животных с превалированием катаболических и резорбтивных процессов.
Одним из основных принципов профилактики и лечения остеопороза является обеспечение поступления в организм оптимального количества кальция [Л.И. Беневоленская, 2003; Н.В. Торопцева, Л.И. Беневоленская, 2005; О.А. Никитская, Н.В. Торопцева, 2011]. Препараты кальция с другими медикаментозными средствами (витамин Д и его активные формы, антирезорбтивные препараты) оказывают положительный лечебный эффект и при лечении хронических заболеваний пародонта, потере МПКТ лицевого скелета [В.Г. Атрушкевич, 2008; E. Kall et al., 2001]. Сотрудниками Ижевской государственной медицинской академии, физико-технического института УрО РАН (г. Ижевск) совместно с институтом органической и физической химии им. А.Е. Абузова Казанского научного центра РАН и Казанского физико-технического института им. Е.К. Завойского КазНЦ РАН разработана нанодисперсная механоактивированная аморфная форма кальциевой соли глюконовой кислоты, показавшая хорошую биохимическую совместимость и терапевтическую эффективность при лечении заболеваний, связанных с нарушением обмена кальция в организме [Н.С. Стрелков и др., 2004; 2008;
Г.Н. Коныгин и др., 2005; 2006; 2009]. Положительное действие соединения авторы связывают с существенным улучшением биодоступности кальция в организме.
Цель исследования. Оценить влияние механоактивированной аморфной формы кальциевой соли глюконовой кислоты и её комбинации с антиоксидантным витаминным препаратом на метаболизм костной ткани периферического и лицевого скелета экспериментальных животных при хронической интоксикации дихлорэтаном.
Задачи исследования.
1. Изучить в костной ткани нижней челюсти и трубчатой кости белых крыс содержание свободного и белковосвязанного оксипролина, гликозаминогликанов, в плазме крови - уровни общего и ионизированного кальция, магния, фосфора, биохимических маркёров ремоделирования кости (С-концевые телопептиды, активность общей и костной щелочной фосфатаз) при хронической интоксикации дихлорэтаном в суммарной дозе 0,1ЛД50 и введении механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формы кальциевой соли глюконовой кислоты (Кальций-МАГ), её комбинации с антиоксидантным препаратом (Триовит).
2. Оценить состояние оксидантно-антиоксидантной системы (интенсивность хемилюминесценции, уровень первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), общую антиоксидантную активность, активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы) в гомогенатах костной ткани нижней челюсти и эпифизов трубчатой кости при хронической интоксикации дихлорэтаном и лечении кальций-МАГом, комбинацией кальций-МАГа с триовитом.
3. Исследовать в плазме крови крыс при интоксикации дихлорэтаном и лечении этих животных кальций-МАГом и его комбинации с триовитом, содержание паратгормона, эстрадиола, тестостерона, гонадотропных гормонов (фолликулостимулирующего, лютеинизирующего и лактикотропного), и кортизола.
4. Изучить влияние лечения кальций-МАГом и его комбинации с триовитом на гистологическую структуру костной ткани нижней челюсти и трубчатой кости при хронической интоксикации дихлорэтаном в суммарной дозе 0,1ЛД50.
Научная новизна. Впервые установлено, что при хронической интоксикации малыми дозами хлорированных производных алифатических углеводородов (дихлорэтан) наблюдаются нарушения метаболизма костной ткани лицевого скелета, характерные для развития остеопенического синдрома в ткани трубчатых костей, и патогенетические механизмы их остеотоксического действия. Впервые показано, что введение механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формы глюконата кальция при интоксикации дихлорэтаном способствует нормализации содержания в периферической крови общего и ионизированного кальция, снижению уровня паратгормона и пролактина, биохимического маркёра костной резорбции – С-концевых телопептидов коллагена типа 1, интенсификации включения в костную ткань улучшению гистологической структуры костной ткани лицевого и периферического скелета, торможению в них катаболизма межклеточного матрикса.
Впервые установлено, что комбинированное лечение механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формой глюконата кальция с витаминным антиоксидантным препаратом при интоксикации малыми дозами дихлорэтана приводит к более выраженному терапевтическому эффекту, чем их раздельное применение, ингибируя катаболические процессы со снижением резорбции, интенсивность липопероксидации, с супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, общей антиокислительной активности костной ткани, усиливая продукцию половых и нормализуя выработку гонадотропных гормонов, предотвращая нарушения гистологической структуры костной ткани нижней челюсти и трубчатых костей периферического скелета экспериментальных животных.
Научно-практическая значимость. Экспериментально подтверждена эффективность использования нанодисперсной формы глюконата кальция для лечения остеопенических состояний. Показано выраженное лечебное влияние комбинированного применения механоактивированной аморфной соли глюконата кальция с витаминным препаратом антиоксидантного действия – триовитом при нарушениях метаболизма костной ткани периодонта и периферического скелета в условиях длительного действия малых доз низкомолекулярных ациклических хлорированных углеводородов (дихлорэтана), что может быть использовано для проведения профилактических мероприятий у работников химических предприятий, имеющих профессиональный производственный контакт с хлорорганическими поллютантами.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Лечение белых крыс механоактивированной аморфной (нанодисперсной) формой глюконата кальция (кальций-МАГ) при хронической интоксикации малыми дозами хлорированного углеводорода – дихлорэтана повышает в крови содержание кальция, фосфора, магния и включение кальция в костную ткань, ингибируя её резорбцию.
2. Применение антиоксидантного витаминного препарата (триовит) при хронической интоксикации дихлорэтаном снижает в костной ткани экспериментальных животных лицевого и периферического скелета процессы липопероксидации, повышает активность основных антиоксидантных ферментов, способствует нормализации фосфорно-кальциевого обмена и гормонального баланса.
3. Использование при экспериментальной интоксикации животных дихлорэтаном комбинации механоактивированной аморфной формы глюконата кальция и антиоксидантного препарата приводит к более выраженному терапевтическому эффекту на метаболизм и микроархитектонику костной ткани, состояние фосфорно-кальциевого обмена и гормональный статус, чем их раздельное применение.
Внедрение результатов исследования в практику.
Основные положения диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры биологической химии, кафедры фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, кафедры патологической физиологии и кафедры общей гигиены с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на 74-й и 76-й итоговых Республиканских научных конференциях студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2009, 2011), на 7-й и 8-й международных научно-практических конференциях «Достижения фундаментальных наук в решение актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2010; 2011), на IV Российском конгрессе по остеопорозу (СПб., 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы гигиенической науки и медицины труда» (Уфа, 2010); научно-практической конференции «Инновации в медицине – решение проблем охраны здоровья нефтехимиков», посвященной 45-летию медслужбы ОАО «Салаватнефтехиморгсинтез» (Салават, 2010); Российской научно-практической конференции «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); на совместном заседании кафедр биологической химии, патологической физиологии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, общей гигиены с курсом гигиенических дисциплин медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ (Уфа, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, включая 5 журнальных статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных исследований.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописи, содержит 18 таблиц и 17 рисунков и приложения на 32 страницах (62 рисунка), состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, заключения, практических рекомендации и списка литературы, включающей 282 источника, в том числе 130 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнены на 288 белых беспородных крысах обоего пола массой 180грамм с соблюдением положении Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным [Т.Б. Касаткина, 2000].
Дизайн исследования представлен на рисунке 1.
ДХЭ в оливковом масле вводили животным внутрижелудочно ежедневно с помощью специального зонда в течение 60 дней в суммарной дозе 50 мг/кг (0,1 ЛД50). Контрольная группа животных получала только оливковое масло. Исследуемые препараты вводили подопытным животным в течение последнего месяца опыта: таблетированную форму кальция глюконата и кальций-МАГ — в оливковом масле в виде суспензии в дозах 253 мг/кг массы в день, триовит — в дозе 50 мг/кг в виде суспензии в 2% растворе крахмала.
В эксперименте использовали таблетки «Кальция глюконата» (ЗАО «Ирбитский фармзавод»), кальций-МАГ — механоактивированную аморфную форму этого же официального препарата, полученного согласно патента на изобретение РФ №2373185 от 20.11.2009 г. [Г.А. Коныгин и др., 2009]. По данным комплексного физико-химического анализа, после механоактивации (измельчения в энергонапряженном устройстве — активаторе) размер частиц составляет 50-300 нм, происходит переход исходного кристаллического порошка в рентгеноаморфное состояние [Г.Н.
Коныгин и др., 2005; Н.С. Стрелков и др., 2008]. Кальций-МАГ прошел государственную регистрацию, имеет сертификат № 77.99.23.3.У.8864.10.08, позволяющий использовать его для профилактических и лечебных целей.
Триовит производится фирмой «KRKA» (Словения), зарегистрирован в России. Одна капсула препарата содержит 40 мг токоферола ацетата (витамин Е), 10 мг бета-каротина, 100 мг аскорбиновой кислоты (витамин С) и 50 мкг селена в комплексе с порошкообразными сухими дрожжами.
Дозировки препаратов рассчитывали с учетом массы и площади поверхности тела животных согласно рекомендациям по перерасчету [И.А. Волчегорский и др., 2000]. Интенсивность хемилюминесценции оценивали с использованием хемилюминометра ХЛ-003 (Россия), содержание общего Са, Р и Мg — наборами реагентов «HUMAN» (Германия), ионов Са2+ - с помощью Fresenius Ionometr-2 (Германия), ОЩФ – «Новофосфаль» ЗАО «Вектор-Бест» (Россия), КЩФ - набором реагентов «Metra BAF EIA Kit»
фирмы Quided Corporation, С-концевых телопептидов коллагена типа I (– Cross Laps) – Serum Cross Laps ELISA фирмы Nordic Biosciense Diagnostic животных 2-я, интоксикация ДХЭ и введение таблетированной формы 3-я, интоксикация ДХЭ и введение механоактивированной аморфной формы глюконата кальция (кальций-МАГ) Исследуемые показатели ФСГ, ЛГ, пролактин, тестостерон, эстрадиол, паратгормон, Хемилюминесценция, уровень продуктов ПОЛ, ОАА, активность Содержание СО и БСО, ГАГ, интенсивность включения Гистологическая структура тканей бедренной кости и нижней челюсти Рисунок 1. Дизайн исследования.
A/S (Дания). Уровень гормонов оценивали, используя стандартные наборы RIA Testosterone direct (Франция), RIA ESTRADIOL (Франция), PROLACTIN IRMA KIT (Чехия), LH IRMA KIT (Чехия), FSH IRMA KIT (Чехия), IMMUNOTECH CORTISOL RIA kit (Чехия), IRMA PTH (Франция). Общую антиоксидантную активность гомогената костной ткани определяли по Г.И.
Клебанову и соавт. (1988), активность каталазы по М.А. Королюку и соавт.
(1988), супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП) с помощью наборов реагентов фирмы Randox Labor Ltd. Содержание продуктов ПОЛ в гептан-изопропаноловых экстрактах исследовали по И.А.
Волчегорскому и соавт. (2000), ТБК-активных продуктов — наборами реагентов «ТБК-АГАТ» (Россия), свободного (СО) и белковосвязанного (БСО) оксипролина и гликозаминогликанов (ГАГ) — по П.Н. Шараеву с соавт. (1990). Биосинтез коллагена оценивали по интенсивности включения С-пролина, интенсивность минерализации — радиоактивного 45Са. Кроме того у животных проводили гистологическую оценку состояния бедренной кости и нижней челюсти, определяли относительную массу, толщину кортикального слоя трубчатых костей по В.В. Поворознюку (2006).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0 фирмы Stat Soft. В группах выборки определяли медиану (Ме) и интерквартильный интервал (25%; 75%). Достоверность межгрупповых различий средних величин оценивали по критерию U МаннаУитни. Критический уровень достоверности (Р) принимали равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При хронической интоксикации ДХЭ у подопытных животных наблюдается падение относительной массы трубчатых костей (бедренной, большеберцовой, плечевой) и толщины их кортикального слоя.Одновременно выявляется и некоторое снижение относительной массы нижней челюсти. У крыс, подвергнутых интоксикации ДХЭ, обнаруживается снижение в плазме крови уровней общего и ионизированного кальция, магния и фосфора (таблица 1), более двух раз повышается активность маркёра резорбции костной ткани — С-концевых телопептидов коллагена типа I, а активность костной щелочной фосфатазы — маркёра остеогенеза повышается незначительно (таблица 2). Эти результаты вполне определённо характеризуют превалирование процессов костной резорбции над гистогенезом костной ткани.
Введение подопытным животным таблетированной формы глюконата кальция не оказывает при интоксикации ДХЭ существенного влияния ни на один из исследуемых показателей костного и фосфорно-кальциевого обмена.
Введение крысам на фоне интоксикации кальций-МАГа несколько повышает относительную массу трубчатых костей, препятствует падению в них толщины кортикального слоя, нормализует в плазме крови уровни общего и ионизированного Са, Р, статистически значимо повышает содержание Мg, снижает интенсивность костной резорбции и повышает остеогенез. Динамика изменений активности КЩФ и уровня -Cross Laps в плазме крови у этой группы животных практически уравновешиваются.
Более благоприятный эффект на состояние метаболизма костной ткани при хронической интоксикации ДХЭ оказывает лечение антиоксидантным препаратом. Особенно демонстративно снижается у этой группы животных уровень С-концевых телопептидов коллагена типа I и активность костной и общей щелочной фосфатаз. Однако в отношении изменений относительной массы отдельных костей и толщины кортикального слоя трубчатых костей, содержания в плазме крови Са общего и Са2+, Mg, Р у крыс, получавших триовит и кальций-МАГ, статистически значимых различий не установлено.
Таблица 1-Влияние кальций-МАГа, триовита и их комбинации на показатели минерального обмена в плазме крови у крыс, подвергнутых интоксикации Контроль 2,2 [1,9; 2,3] 1,03 [0,89; 1,11] 0,78 [0,72; 1,07] 1,25 [1,19; 1,35] 1-я 1,9 [1,8; 2,2] 0,84 [0,80; 0,90] 0,72 [0,66; 0,78] 0,79 [0,54; 1,11] 2-я 2,0 [1,9; 2,1] 0,87 [0,82; 0,93] 0,85 [0,82; 0,94] 0,92 [0,75; 1,13] кальция) 3-я 2,1 [2,0; 2,4] 0,95 [0,82; 0,98] 1,07 [1,05; 1,15] 1,19 [1,08; 1,30] 4-я 2,0 [1,7; 2,1] 0,90 [0,85; 0,93] 1,03 [0,88; 1,11] 1,08 [1,02; 1,19] 5-я 2,2 [2,0; 2,4] 1,05 [0,93; 1,10] 1,08 [1,02; 1,11] 1,19 [1,03; 1,22] Примечание. В этой таблице и последующих: Р — различия с контрольной, Р1 — с первой, Р2 — со второй, Р3 — с третьей, Р4 — с четвертой группами крыс.
«